基于AMPK/mTOR信号通路研究膝痹宁方对膝骨关节炎模型大鼠的改善作用机制 Δ

廖太阳 ，张力 ，杨楠 ，魏义保 ，吕璟先 ，徐波 ，丁亮 ，王培民 ，张立 （.南京中医药大学附属医院/江苏省中医院骨伤科，南京 009；.南京中医药大学附属苏州市中医医院骨伤科，江苏 苏州 5007）

膝骨关节炎（knee osteoarthritis，KOA）是一种全关节疾病，该病病因复杂，软骨退变是其核心病理环节[1]。软骨退变主要是由于软骨细胞合成代谢及细胞外基质（extracellular matrix，ECM）分解代谢平衡失调所致，因此，维持软骨组织自身的代谢平衡在KOA的治疗中具有十分关键的作用，对于延缓KOA发展进程至关重要[2]。研究显示，以血小板反应蛋白解整合素金属肽酶4（disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motifs 4，ADAMTS-4）、ADAMTS-5、基质金属蛋白酶3（matrix metalloproteinase3，MMP-3）、MMP-13为代表的胶原水解酶，对关节软骨具有破坏作用[3—4]；而聚集蛋白聚糖（Aggrecan）对关节软骨具有保护作用[5—6]。另外，越来越多的研究表明，调控腺苷酸活化蛋白激酶（AMP-activated protein kinase，AMPK）/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）信号通路对软骨具有保护效应[7—9]。

基于KOA中医学“寒、瘀、虚”的病机特点，南京中医药大学附属医院骨伤科王培民教授研制了中药复方——膝痹宁方（XBN），该方由制狗脊、山萸肉、生薏苡仁、川牛膝、制何首乌、生甘草等11味中药组成，且已获国家专利（专利号为CN201010514325），在临床上主要用于治疗骨关节退行性疾病导致的慢性疼痛，疗效显著[10—11]。本课题组前期研究也发现，XBN可改善KOA模型大鼠的滑膜炎症和疼痛[12]，但具体作用机制尚不明确。基于此，笔者拟基于AMPK/mTOR信号通路探讨XBN改善KOA的作用机制，以期为XBN的临床应用提供实验基础。

1 材料

1.1 主要仪器

本研究所用主要仪器包括AB7500型荧光定量聚合酶链式反应（qPCR）系统（美国ABI公司），HistoCore型组织切片机、TP1020型组织脱水机、KD-BMⅢ型组织包埋机、MI-3000B型倒置显微镜（德国Leica公司），BioPhotometer-Plus型多功能核酸蛋白检测系统（德国Eppendorf公司），170-3930型垂直凝胶电泳及转膜系统（美国Bio-Rad公司），LAS4000型凝胶成像发光系统（美国GE公司）等。

1.2 主要药品与试剂

制狗脊、山萸肉、生薏苡仁、川牛膝、制何首乌、生甘草药材均购自康美药业股份有限公司（批号分别为211201171、220101031、220202271、220200041、211003211、211200251），巴戟天、炒白芍（批号分别为220100129、220400529）购自康美（亳州）世纪国药有限公司，淡附片（批号22030206）购自康美滕王阁（四川）制药有限公司，桂枝（批号220101）购自普宁市泽群中药饮片有限公司，紫河车（批号211001）购自安徽道源堂中药饮片有限公司。上述药材经南京中医药大学附属医院骨伤科王培民教授鉴定为真品。二甲双胍（AMPK激动剂，批号R000310）购自上海易恩化学技术有限公司；番红O-固绿染色试剂盒（批号YM1011）购自南京伊尔美生物科技有限公司；兔源ADAMTS-4多克隆抗体、兔源ADAMTS-5多克隆抗体（批号分别为A02899、A02802-1）均购自美国Boster公司；兔源Aggrecan多克隆抗体、兔源MMP-3多克隆抗体、兔源MMP-13多克隆抗体、小鼠源GAPDH单克隆抗体（批号分别为13880-1-AP、17873-1-AP、18165-1-AP、60004-1-Ig）均购自美国 Proteintech公司；兔源AMPK单克隆抗体、兔源磷酸化AMPK（p-AMPK）单克隆抗体、mTOR单克隆抗体、兔源磷酸化mTOR（p-mTOR）单克隆抗体（批号分别为2532S、50081S、2983S、5536S）均购自美国CST公司；辣根酶素标记的山羊抗兔免疫球蛋白G（IgG）二抗（批号K1223）均购自美国APExBIO公司；BCA试剂盒（批号P0012）购自上海Beyotime公司；青霉素钠（批号F0112104）购自华北制药股份有限公司。

1.3 实验动物

本研究所用实验动物为SPF级SD雄性大鼠，共36只，体质量190～200 g，2月龄，由浙江省医学科学院提供，动物生产许可证号为SCXK（浙）2019-0002。所有大鼠均分笼饲养于光/暗各12 h、室温（25±2） ℃、相对湿度（60±5）%的动物房内，自由摄食、饮水。动物实验方案经南京中医药大学动物伦理委员会审核批准，批准号为ACU210101。

2 方法

2.1 药物制备

按照文献[10]方法将XBN的11味中药按处方比例称取适量，将除淡附片、紫河车的其余9味中药加8倍量（g/mL，下同）水浸泡30 min。用武火将淡附片煎至沸腾，再以文火煎30 min，加入上述浸泡后的中药，煎至沸腾后继续煎煮30 min，滤过；再加6倍量水，煎至沸腾后再煎30 min，滤过；合并2次滤液，最后加入研磨成粉的紫河车，浓缩成质量浓度为1.2 g/mL（以生药量计）的XBN溶液。

2.2 动物分组、给药与造模

将大鼠随机分为空白组、模型组、XBN组（12.56 g/kg，剂量为临床等效剂量）和XBN+二甲双胍组（12.56 g/kg XBN+100 mg/kg二甲双胍，二甲双胍剂量参考文献[13]设置），每组9只。空白组大鼠仅切开皮肤而不开放膝关节腔，其余各组大鼠采用离断前交叉韧带的方法建立KOA模型[14]，具体方法如下：用2%戊巴比妥钠（50 mg/kg）腹腔注射麻醉大鼠后，备皮、消毒，纵向切口打开膝关节腔，髌骨脱位后用手术刀离断前交叉韧带，然后逐层缝合；术后连续肌内注射青霉素钠3 d以预防感染。造模14 d后，大鼠前抽屉试验阳性，表明造模成功。空白组与模型组大鼠灌胃等体积生理盐水，各给药组大鼠给予相应药物，XBN和生理盐水每天灌胃1次，二甲双胍隔天腹腔注射1次，连续4周。

2.3 大鼠软骨组织病理形态学观察

采用番红O-固绿染色法进行检测。末次给药24 h后，将各组大鼠处死，剖取软骨组织。取3只大鼠的软骨组织（其余大鼠软骨组织于-80 ℃下保存备用）清理干净后流水冲洗，置于4%多聚甲醛中固定3～5 d，再以10% EDTA溶液脱钙4周；经梯度浓度的乙醇脱水、二甲苯透明、浸蜡包埋后，切片（厚度为5 μm）；将切片脱蜡至水后，进行番红O-固绿染色，以自来水冲洗后，用1%冰醋酸分色3 s，经无水乙醇脱水、二甲苯透明及中性树胶封片后，观察各组大鼠软骨组织的病理学形态并拍照，参照Mankin评分标准评估大鼠软骨组织的病理形态学变化[15]。

2.4 大鼠软骨组织中Aggrecan蛋白表达水平的检测

采用免疫荧光染色法进行测定。每组随机取3只大鼠冻存的软骨组织，按“2.3”项下方法制备石蜡切片，使用二甲苯和梯度浓度的乙醇分别进行脱蜡和水合后，滴加适量的EDTA完成抗原修复，滴加3%BSA溶液封闭30 min；加入Aggrecan一抗（稀释度为1∶500），于4 ℃孵育过夜；滴加二抗，于室温孵育1 h；滴加DAPI染色液，于室温下静置15 min；用水冲洗后，滴加适量抗荧光淬灭剂，转移组织切片于显微镜下进行观察（Aggrecan蛋白的阳性表达呈红色荧光），使用Image J v1.53f软件分析各组蛋白的荧光强度（荧光强度越大，表示蛋白表达水平越高）。

2.5 大鼠软骨组织中分解代谢相关基因mRNA表达水平的检测

采用qPCR方法进行检测。每组随机取3只大鼠冻存的软骨组织，经液氮研磨裂解后，常规提取软骨组织总RNA，再逆转录为cDNA。以cDNA为模板，进行PCR（PCR引物序列和产物长度见表1）。PCR反应体系为上、下游引物各0.4 µL，cDNA 1 µL，2×SYBR qPCR Master Mix 10 µL，ddH2O 8.2 µL。PCR 反应条件为95 ℃预变性5 min；95 ℃变性10 s，60 ℃退火20 s，72 ℃延伸20 s，共40个循环。以GAPDH为内参，采用2-ΔΔCt法计算各目的基因mRNA的表达水平。

表1 PCR引物序列和产物长度

2.6 大鼠软骨组织中分解代谢和AMPK/mTOR信号通路相关蛋白表达水平的检测

采用Western blot法进行测定。每组随机取3只大鼠冻存的软骨组织，经液氮研磨裂解后，离心，取上清液15 μL测定蛋白含量，其余上清液煮沸变性，然后进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，转膜，以5%脱脂奶粉封闭1 h；加入GAPDH、ADAMTS-4、ADAMTS-5、MMP-3、MMP-13、AMPK、p-AMPK、mTOR、p-mTOR一抗（稀释度分别为1∶50 000、1∶1 000、1∶1 000、1∶1 000、1∶2 000、1∶1 000、1∶1 000、1∶1 000、1∶1 000），4 ℃孵育过夜；以TBST洗膜10 min×3次，加入二抗（稀释度为1∶5 000），室温孵育1 h；以TBST溶液洗膜10 min×3次，加入ECL显色，采用凝胶成像发光系统显影曝光。采用Image J v1.53f软件对各组蛋白条带进行分析，以ADAMTS-4、ADAMTS-5、MMP-3、MMP-13与内参GAPDH灰度值的比值表示其表达水平；以p-AMPK与AMPK、p-mTOR与mTOR的灰度值比值表示AMPK、mTOR的磷酸化水平。

2.7 统计学方法

采用SPSS 20.0软件对数据进行统计分析，使用GraphPad 7.04软件绘图。数据以±s表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验。检验水准α＝0.05。

3 结果

3.1 XBN对模型大鼠软骨组织病理学形态的影响

空白组大鼠软骨结构完整，层次分明，呈现均匀红色，软骨浅表层光滑完整，软骨细胞规律排列，潮线清晰可见，软骨下骨呈现蓝色，软骨下骨板厚度正常。模型组大鼠软骨组织结构分层紊乱，软骨损伤至辐射层，软骨层明显变薄且软骨浅表层不平滑，软骨层基质淡染，软骨细胞排列紊乱，潮线出现扭曲或中断，软骨下骨与软骨层难以区分。XBN组大鼠软骨退变程度位于空白组与模型组之间，软骨浅表层较为光滑、缺损减少，软骨结构分层较为清晰，基质染色相对均匀，软骨细胞排列较为规则，潮线尚完整。XBN+二甲双胍组大鼠软骨病变程度较XBN组进一步减轻。结果见图1。

图1 各组大鼠软骨组织病理形态学显微图（番红O-固绿染色，×200）

Mankin评分结果显示，与空白组比较，模型组大鼠Mankin评分显著升高（P＜0.05）；与模型组比较，各给药组大鼠Mankin评分均显著降低（P＜0.05）；与XBN组比较，XBN+二甲双胍组大鼠Mankin评分显著降低（P＜0.05）。结果见表2。

3.2 XBN对模型大鼠软骨组织中Aggrecan蛋白表达的影响

与空白组比较，模型组大鼠软骨组织中Aggrecan蛋白表达水平显著降低（P＜0.05）。与模型组比较，各给药组大鼠软骨组织中Aggrecan蛋白表达水平均显著升高（P＜0.05）。与XBN组比较，XBN+二甲双胍组大鼠软骨组织中Aggrecan蛋白表达水平均显著升高（P＜0.05）。结果见图2、表2。

表2 各组大鼠Mankin评分和软骨组织中Aggrecan蛋白表达水平测定结果（±s，n=3）

表2 各组大鼠Mankin评分和软骨组织中Aggrecan蛋白表达水平测定结果（±s，n=3）

a：与空白组比较，P＜0.05；b：与模型组比较，P＜0.05；c：与XBN组比较，P＜0.05

组别空白组模型组XBN组XBN+二甲双胍组Mankin评分1.16±0.55 8.33±0.82a 3.25±0.61b 2.08±0.66c Aggrecan蛋白表达水平44.75±0.96 3.80±0.89a 24.19±0.92b 29.92±0.42c

图2 各组大鼠软骨组织中Aggrecan蛋白表达的免疫荧光图（×200）

3.3 XBN对模型大鼠软骨组织中分解代谢相关基因mRNA表达的影响

与空白组比较，模型组大鼠软骨组织中ADAMTS-4、ADAMTS-5、MMP-3、MMP-13 mRNA的表达水平均显著升高（P＜0.05）；与模型组比较，各给药组大鼠软骨组织中上述指标水平均显著降低（P＜0.05）；与XBN组比较，XBN+二甲双胍组大鼠软骨组织中上述指标水平均显著降低（P＜0.05）。结果见表3。

表3 各组大鼠软骨组织中分解代谢相关基因mRNA的表达水平测定结果（±s，n=3）

表3 各组大鼠软骨组织中分解代谢相关基因mRNA的表达水平测定结果（±s，n=3）

a：与空白组比较，P＜0.05；b：与模型组比较，P＜0.05；c：与XBN组比较，P＜0.05

组别空白组模型组XBN组XBN+二甲双胍组ADAMTS-4 mRNA 1.00±0.00 1.91±0.08a 1.48±0.07b 1.23±0.04c ADAMTS-5 mRNA 1.00±0.00 1.61±0.08a 1.37±0.06b 1.19±0.08c MMP-3 mRNA 1.00±0.00 2.57±0.06a 1.91±0.04b 1.66±0.11c MMP-13 mRNA 1.00±0.00 2.23±0.07a 1.62±0.07b 1.38±0.05c

3.4 XBN对模型大鼠软骨组织中分解代谢相关蛋白表达的影响

与空白组比较，模型组大鼠软骨组织中ADAMTS-4、ADAMTS-5、MMP-3、MMP-13蛋白的表达水平均显著升高（P＜0.05）；与模型组比较，各给药组大鼠软骨组织中上述指标水平均显著降低（P＜0.05）；与XBN组比较，XBN+二甲双胍组上述指标水平均显著降低（P＜0.05）。结果见图3、表4。

图3 各组大鼠软骨组织中分解代谢相关蛋白表达的电泳图

表4 各组大鼠软骨组织中分解代谢相关蛋白的表达水平测定结果（±s，n=3）

表4 各组大鼠软骨组织中分解代谢相关蛋白的表达水平测定结果（±s，n=3）

a：与空白组比较，P＜0.05；b：与模型组比较，P＜0.05；c：与XBN组比较，P＜0.05

MMP-13/GAPDH 0.43±0.07 1.66±0.07a 1.37±0.06b 0.89±0.13c组别空白组模型组XBN组XBN+二甲双胍组ADAMTS-4/GAPDH 0.21±0.09 1.33±0.07a 0.48±0.03b 0.33±0.04c ADAMTS-5/GAPDH 0.28±0.06 1.21±0.16a 0.65±0.07b 0.36±0.06c MMP-3/GAPDH 0.53±0.12 1.83±0.11a 1.25±0.09b 0.81±0.08c

3.5 XBN对模型大鼠软骨组织中AMPK/mTOR信号通路相关蛋白表达的影响

与空白组比较，模型组大鼠软骨组织中AMPK蛋白的磷酸化水平显著降低（P＜0.05），mTOR蛋白的磷酸化水平显著升高（P＜0.05）；与模型组比较，各给药组大鼠软骨组织上述指标水平均显著逆转（P＜0.05）；与XBN组比较，XBN+二甲双胍组大鼠软骨组织中AMPK蛋白的磷酸化水平显著升高（P＜0.05），mTOR蛋白的磷酸化水平显著降低（P＜0.05）。结果见图4、表5。

图4 各组大鼠软骨组织中AMPK/mTOR信号通路相关蛋白表达的电泳图

表5 各组大鼠软骨组织中AMPK/mTOR信号通路相关蛋白的磷酸化水平测定结果（±s，n=3）

表5 各组大鼠软骨组织中AMPK/mTOR信号通路相关蛋白的磷酸化水平测定结果（±s，n=3）

a：与空白组比较，P＜0.05；b：与模型组比较，P＜0.05；c：与XBN组比较，P＜0.05

p-mTOR/mTOR 0.21±0.03 2.56±0.09a 1.62±0.09b 0.88±0.11c组别空白组模型组XBN组XBN+二甲双胍组p-AMPK/AMPK 1.98±0.13 0.32±0.05a 0.71±0.07b 1.19±0.06c

4 讨论

KOA归属于中医“痹证”“痿证”“骨痹”“筋痹”等范畴，病机多为本虚标实，肝肾不足为本，风寒湿邪气外侵为标[1]。XBN具有补益肝肾、温经散寒、柔肝养血的功效[10]。本课题组前期研究显示，XBN对KOA具有较好的治疗作用[10—12]，但具体作用机制至今尚未完全阐明。本研究通过对KOA模型大鼠的软骨组织进行番红O-固绿染色发现，与空白组相比，模型组大鼠软骨组织结构分层紊乱，表面不平整，软骨细胞分布不均匀，软骨层基质淡染，潮线出现中断，且Mankin评分显著升高；经过XBN或XBN+二甲双胍干预后，大鼠软骨上述病理改变均明显减轻，且Mankin评分明显降低。这表明XBN能明显改善大鼠软骨组织的病理损伤。

KOA最显著的病理变化是关节软骨渐进式的降解、退变和破坏，表现为软骨蛋白合成酶减少而分解酶大量释放，从而导致软骨胶原亚型发生改变，软骨厚度变薄、破损，进而失去正常的生物学功能[3—6]。本研究通过检测各组大鼠软骨合成和分解代谢指标发现，模型组大鼠软骨组织中合成代谢指标Aggrecan蛋白表达水平显著降低，分解代谢指标ADAMTS-4、ADAMTS-5、MMP-3、MMP-13蛋白和mRNA的表达水平均显著升高。经过XBN或XBN+二甲双胍干预后，大鼠软骨组织中上述指标水平均显著逆转。这说明XBN可促进软骨合成Aggrecan，减少软骨降解，从而发挥改善KOA的作用。

AMPK是一种保守的异质三聚体蛋白激酶，能通过影响细胞物质代谢的多个环节维持细胞能量供求平衡，被称为人体代谢的“总开关”和“能量感受器”[16]。相关研究显示，在小鼠骨关节炎软骨和衰老的软骨细胞中均观察到AMPK活性的降低[8]。在异常应力、氧化应激等因素的作用下，软骨细胞可激活AMPK，阻断mTOR的磷酸化，并通过调节核转录因子κB/沉默信息调节因子1等信号通路，降低白细胞介素6、肿瘤坏死因子α等炎症因子表达，保护软骨细胞并抑制炎症[9]。二甲双胍是一种AMPK激动剂，被证明可通过调控AMPK/mTOR信号通路，减轻小鼠内侧半月板失稳术后的关节软骨破坏[7]。本研究结果显示，经XBN或XBN+二甲双胍干预后，大鼠软骨组织中AMPK蛋白的磷酸化水平显著升高，mTOR蛋白的磷酸化水平显著降低。这表明，XBN可通过激活AMPK/mTOR信号通路改善KOA。

综上所述，XBN可改善KOA模型大鼠的软骨损伤，促进软骨合成，减少软骨降解，其作用机制可能与激活AMPK/mTOR信号通路有关。