人载脂蛋白A1的表达、纯化与羊多抗血清制备

杨欣，赵邑，潘薇薇，梁欣欣，张全爱

（山西省生物研究院有限公司，山西太原 030006）

载脂蛋白A1（ApoA1）是ApoA族最多的一种组分，ApoA1为单一多肽链，由243个氨基酸残基组成，分子量为26 kDa，无糖基化和二硫键，是高密度脂蛋白（HDL）的主要结构蛋白，占HDL蛋白质的65%～70%，而其他脂蛋白中载脂蛋白A1极少，故载脂蛋白A1是HDL的特征性载脂蛋白。血清载脂蛋白A1水平反映HDL的水平，国内外许多研究结果表明，载脂蛋白A1极易同体内的脂类物质亲和，并将之运送至肝脏进行分解代谢，从而避免因血浆中的脂类物质过多造成沉积，发生一系列的心血管系统疾病。人血清中载脂蛋白A1的含量十分丰富[1]，其浓度为1.0～1.2 mg/mL[2]。研究发现[3-4]，载脂蛋白A1是细胞胆固醇逆向转运的特殊重要因素，能与磷脂、多种血浆因子及细胞膜受体结合，参与血浆蛋白的分泌及细胞受体识别脂蛋白的标志，从而调节HDL代谢。此外，还可激活软磷脂胆固醇酰基转移酶，促进细胞内胆固醇的运出、酯化和转移[5]。

近年来，高密度脂蛋白（High-Density Lipoprotein，HDL）及其主要结构蛋白载脂蛋白Al以其保护动脉粥样硬化的作用而闻名[6-7]。动脉粥样硬化性心血管疾病的增多，使人们日益关注载脂蛋白A等相关危险因子在临床中的检测。目前，已有大量临床研究明确指出载脂蛋白A1等是当前临床实验室脂类检测项目中预测动脉粥样硬化性心血管疾病最优价值的指标[8]。载脂蛋白A1已被用来监测药物或饮食治疗心血管疾病的疗效，并有助于某些异常脂蛋白血症的特异性诊断，因此载脂蛋白A1是生物检测的重要原料。

目前载脂蛋白A1的制备主要依赖天然提取，天然提取的原料为人血浆，采用密度梯度离心法制备存在生产量少[9-11]、对设备的要求高、原料获取困难以及不适合企业规模化生产等问题，为了改变这一现状，研究者们采用离子交换柱法、疏水层析法、大柱电泳法、金属离子法、层析聚焦法来提取人血浆中ApoA-1，但均存在蛋白纯度低的问题[12-17]。基于此，本文研究了载脂蛋白A1的蛋白结构，载脂蛋白A1无二硫键、糖基化修饰，可用于原核表达，利用重组表达的蛋白对山羊进行免疫制备抗血清。

1 材料与方法

1.1 菌株

感受态DH5α、BL21（DE3），天根生化科技（北京）有限公司；原核表达载体pET-28a来自本实验室。

1.2 试剂

Taq PCR预混液（1 mL），上海生工生物工程股份有限公司；限制性内切酶NdeI（2 000 units）、XhoI（2 500 units），NEB（北京）有限公司；T4连接酶（24 000 U），天根生化科技（北京）有限公司；酵母粉（500Grams），英国OXOID公司；胰蛋白胨（500Grams），英国OXOID公司；硫酸卡那霉素（5G），上海生工生物工程股份有限公司；IPTG，纯度≥99.0%，生工生物工程（上海）股份有限公司；咪唑，纯度≥99.5%，生工生物工程（上海）股份有限公司；三（羟甲基）氨基甲烷（Tris），规格500 g，生工生物工程（上海）股份有限公司；氯化钠，纯度≥99.5% 生工生物工程（上海）股份有限公司；碳酸钠，纯度≥99.5%；碳酸氢钠，纯度≥99.5%；DEAE基质（500 mL）美国GE Healthcare公 司；Ni Sepharose High performance（1 mL），美国GE Healthcare公司；弗氏佐剂：弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂（10 mL），德国Sigma公司；牛血清白蛋白（5 g），生工生物工程（上海）股份有限公司；TMB双组分显色液（500 mL），北京索莱宝科技有限公司；SDS-PAGE变性丙烯酰胺凝胶快速制备试剂盒（100 mL），生工生物工程（上海）股份有限公司；考马斯亮蓝蛋白快速染色液（500 mL），北京索莱宝科技有限公司；BCA蛋白浓度测定试剂盒（增强型），规格P0010S，上海碧云天生物技术有限公司；HRP标记兔抗山羊IgG（100 μL），生工生物工程（上海）股份有限公司；ELISA 终止液（100 mL），生工生物工程（上海）股份有限公司；载脂蛋白A（ApoA1）测定试剂盒（免疫比浊法），北京安图生物工程有限公司。

1.3 仪器与设备

C1000 Touch Thermo Cycler PCR仪，美国Bio-Rad公司；HERAEUS Pico 21离心机，美国Thermo公司；Mini-PROTEAN® Tetra垂直电泳槽，美国Bio-Rad公司；DYY-BC电泳仪，北京六一生物科技有限公司；UVD-680-3双束紫外检测仪，上海金达生化仪器有限公司；7600-010全自动生化分析仪，日立（中国）有限公司。

1.4 实验方法

1.4.1 引物合成与扩增

参照GenBank报告的人ApoA1序列（GenBank：A11693.1）及其限制性核酸内切酶位点分析结果，设计PCR引物用于扩增载脂蛋白A1，长度为732 bp，编码244个氨基酸，上游引物5’-GCTACATATG(NdeI)GATGAACCACCACAGAGC-3’，下游引物5’-GAGTCT CGAG(XhoI)CTGAGTGTTCAACTTC-3’，委托生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

PCR反应条件：94 ℃ 5 min，94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 50 s，30 个循环；72 ℃ 10 min。

1.4.2 表达载体的构建

PCR扩增产物0.8%琼脂糖凝胶电泳后经溴化乙锭（EB）染色，扩增产物用琼脂糖凝胶纯化试剂盒回收，双酶切（NdeI、XHOI）双酶切后按目的片段与载体片段3∶1比例将目的基因片段与线性化的表达载体pET-28a混合，用T4连接酶16 ℃过夜连接，连接产物转化至E.coli DH5α感受态细胞中，接种于含50 μg/mL卡那霉素（Kan）-LB平板，于37 ℃培养过夜。挑取单菌落在LB培养液中过夜培养，第2天转接至新鲜的LB培养液中，37 ℃ 300 r/min振荡培养4～6 h增菌，用菌落PCR鉴定菌液，阳性菌液用细菌质粒提取试剂盒（天根）提取质粒后送至（生工）测序。

1.4.3 重组蛋白的诱导和表达

将测序正确的载脂蛋白A1-pET-28a转化至E.coli BL21（DE3）感受态细胞中，接种至卡那霉素-LB平板于37 ℃培养过夜，挑取单个菌落接种于卡那霉素-LB培养液中，37 ℃、200 r/min振荡培养至OD600值约为0.6，然后加入1.0 mmol/L IPTG，37 ℃、220 r/min培养过夜，8 000×g离心，超声破碎。采用离子交换层析（DEAE填料）（平衡液：20 mmol/L Tris pH 8.0； 洗 脱 液：20 mmol/L Tris，250 mmol/L NaCl，pH 8.0）与Ni-NTA（平衡液：20 mmol/L Tris，250 mmol/L NaCl，pH 8.0； 洗 脱 液：20 mmol/L Tris，250 mmol/L NaCl，250 mmol/L 咪唑，pH 8.0）亲和层析柱纯化表达的载脂蛋白A1。

1.4.4 蛋白浓度及活性检测

1.4.4.1 BCA法测定蛋白浓度

使用BCA蛋白浓度测定试剂盒，将标准品按0 μL、1 μL、2 μL、4 μL、8 μL、16 μL 和 20 μL加到96孔板的标准品孔中，加标准品稀释液补足到20 μL，相当于标准品浓度分别为0.000 mg/mL、0.025 mg/mL、0.050 mg/mL、0.100 mg/mL、0.200 mg/mL、0.300 mg/mL、0.400 mg/mL 和0.500 mg/mL；加适当的样品到96孔板的样品孔；各孔加入200 μL BCA工作液，于37 ℃放置20～30 min；用酶标仪测定A562；根据标准曲线和使用的样品体积计算出样品的蛋白浓度。

1.4.4.2 免疫比浊法测定载脂蛋白A1活性

使用载脂蛋白A1测定试剂盒（免疫比浊法）检测，用去离子水稀释校准品，以水位为零点，建立工作曲线；将样品与质控品同时在生化仪上进行检测，并计算出载脂蛋白A1的浓度。

1.4.5 载脂蛋白A1的免疫

选取山西省高平市山羊4只（编号为144、145、170、190），共计免疫6次。佐剂：弗氏佐剂，第1次免疫为完全佐剂，间隔21 d，第2次以后用不完全佐剂，每次间隔时间为14 d，免疫剂量为2.5 mg。3免后定期采集山羊的免疫血清。

1.4.6 双向琼脂扩散试验鉴定多克隆抗体

在平皿上配制1.2%的琼脂平板，厚度控制在3 mm左右，用滴管头部以梅花型排列方式打一组小孔，通过酒精灯火焰微微加热封底，并对各孔标号。中央孔加入羊抗人ApoA1的阳性抗血清10 μL，1～5孔分别加入不同稀释倍数的待检测蛋白溶液（1∶4、1∶8、1∶16、1∶32），6孔加生理盐水作为阴性对照。37 ℃孵育24～36 h，取出后观察结果，有白色沉淀线的为阳性反应。

1.4.7 间接酶联免疫吸附测定法（Elisa）测定多克隆抗体效价

将0.01 mol/L碳酸盐缓冲液（pH 9.6）作为包被液包被纯化的载脂蛋白A1，包被量每孔为100 ng，设免疫前血清作为阴性对照，4 ℃过夜，37 ℃条件下用1% BSA封闭2 h。将山羊抗血清进行倍比稀释作为一抗，一抗于37 ℃孵育1 h；HRP标记兔抗山羊IgG为二抗，二抗于37 ℃孵育1 h。TMB为显色底物，用ELISA 终止液终止反应后用酶标仪测定各孔OD450值并分析结果。

计算阳性血清与阴性血清的吸光度之比，当阳性血清/阴性血清＜1.5时为阴性，当阳性血清/阴性血清≥2.1为阳性，将阳性血清/阴性血清≥2.1时所对应的抗体最高稀释倍数作为多克隆抗体的效价。

2 结果与分析

2.1 载脂蛋白A1 PCR片段扩增结果

PCR产物经0.8%的琼脂糖凝胶电泳检测，可见在750 bp左右处有扩增产物，见图1。重组质粒经NdeI、XhoI双酶切后，与线性化载体pET-28a连接，连接产物转化至E.coli DH5α感受态细胞中，使用pET-28a通用引物（T7 5-TAATACGACTCA TATAGGG-3；T7t 5-GCTAGTTATTGCTCAGCGG-3）进行菌液PCR扩增，pET-28a质粒作为对照扩增片段大小为280 bp左右，见图2（a）。如图2（b）所示，载脂蛋白A1-pET-28a扩增片段为1 100 bp左右，泳道4、泳道5为阳性质粒。阳性质粒进行测序，测序结果与GeneBank报告的人载脂蛋白A1序列完全相同。

图1 载脂蛋白A1PCR扩增产物

图2 菌落PCR结果

2.2 载脂蛋白A1的表达和纯化结果

将测序正确的质粒转入E.coli BL21-DE3中，用1 mmol/L IPTG诱导过夜，诱导表达后，菌液8 000×g离心20 min，超声破碎后，SDS-PAGE结果显示，载脂蛋白A1能高效表达，并以可溶形式表达（见图3），蛋白大小为26 kDa，与预期一致。经离子交换层析与Ni-NTA亲和层析后显示为单一的蛋白条带（见图4）。

图3 载脂蛋白A1重组表达结果

图4 载脂蛋白AI的纯化

2.3 蛋白浓度检测及活性检测

用Bradford蛋白浓度测定试剂盒测定载脂蛋白A1浓度，纯化后的蛋白稀释8倍，A562读数为0.674 3，根据图5标准曲线可得，蛋白总浓度为4.8 mg/mL。稀释4倍后，蛋白总浓度为1.2 mg/mL；经载脂蛋白A1测定试剂盒（免疫比浊法）测定该蛋白中载脂蛋白A1的含量为1.15 mg/mL，纯度达到95.5%。

图5 BCA法测定蛋白浓度标准曲线

2.4 双向琼脂扩散试验

采集免疫后的羊血清，选择不同浓度稀释后进行琼脂扩散试验，如图6所示，出现特异条带判定为阳性，出现条带的最大稀释倍数即为抗体效价。制备的羊抗人ApoA1抗血清对ApoA1抗原呈阳性反应，效价为1∶16。

图6 双向琼脂扩散实验结果

2.5 山羊免疫及效价测定

第3次免疫后采血进行Elisa检测，4只羊（山羊编号为144、145、170、190）的抗血清最高效价为1∶512 000，最低效价为1∶256 000（见图7），个体存在差异，但均达到免疫效价要求。

图7 羊抗血清效价测定结果

3 讨论

大量临床研究表明，载脂蛋白A1是预测冠心病最有价值的指标之一，同时也是其他脂类代谢紊乱疾病等的辅助观察项目[18]。载脂蛋白A1检测试剂盒广泛用于临床冠心病的诊断，因此羊抗人载脂蛋白A1抗血清是该检测试剂的关键核心原料。目前，该检测试剂大部分依赖进口，主要原因是载脂蛋白A1的制备、纯化工艺、免疫动物以及免疫方法等不成熟。

本文采用基因重组方法，原核表达载脂蛋白A1，表达量大且表达产物以可溶形式存在，在一定程度上减少了包涵体变复性的烦琐工作。Ni-NTA亲和层析法纯化后蛋白纯度较低，为解决这一问题，本文采用两步法纯化载脂蛋白A1，先经离子交换层析去除部分杂蛋白，再经Ni-NTA亲和层析获得较高纯度的蛋白。经载脂蛋白A1活性检测试剂盒检测，该蛋白的活性较高，可作为天然载脂蛋白A1的替代品用于山羊的免疫。该方法的建立可应用于工业化生产。

在载脂蛋白A1抗山羊血清的制备中，本实验着重在山羊选取、抗原乳化、免疫程序、免疫途径等几个方面进行了优化。本次实验选取的山羊位于山西省晋城市高平县内，该地域昼夜温差大，森林覆盖率高，优质的牧草资源为山羊的养殖提供了得天独厚的自然条件，也为蛋白免疫提供了基础，优化抗原免疫量，皮下多点注射是一种诱导抗体产生的较佳的免疫途径，通过该方法获得了很好的免疫效果。本文分别免疫4只山羊，效价均能达到1∶100 000以上。个体之间也存在差异，其中最高效价达到1∶512 000，最低效价1∶256 000。所制备的抗血清为载脂蛋白A1的检测分析和相关研究提供了重要的工具，可为我国医药企业自主生产羊抗人载脂蛋白A1抗血清提供技术支撑，有助于减少进口依赖，提升我国该领域的研究水平。

4 结论

本文成功制备了重组载脂蛋白A1，并将该蛋白用于山羊免疫，得到了效价较高的抗血清，方法简单，适合大规模生产。今后还需继续提高载脂蛋白A1纯化的效率，优化蛋白免疫方案，提升山羊的免疫效价。