小檗碱对低分化子宫内膜腺癌细胞AN3CA的抑制作用研究

姜玉婷 孙雯雯 李 佳 刘西鹏 徐丽君 刘光海 张毅芳▲

1.山东第一医科大学第二附属医院中医科，山东泰安 271000；2. 山东第一医科大学第二附属医院病理科，山东泰安 271000；3. 山东第一医科大学第二附属医院妇产科，山东泰安 271000

子宫内膜癌是女性常见的恶性肿瘤，在我国生殖系统恶性肿瘤中其发病率仅低于宫颈癌，而在美国其发病位居女性生殖系统恶性肿瘤之首，子宫内膜腺癌是最常见的类型。子宫内膜癌大多早期发现，预后较好。但具有低分化等高危因素的患者，治疗难度增加，术后多需辅助放疗或化疗，预后不佳。近年来一些副反应小、摄入方便的中药在肿瘤治疗中研究增多。小檗碱（berberine，BB），又称黄连素，属于季铵生物碱，异喹啉类，以往临床上主要用于治疗胃肠炎、细菌性痢疾等，近年来发现小檗碱还具有免疫调节等作用。在肿瘤的研究中，相应浓度小檗碱作用肿瘤细胞后，肿瘤细胞生长受到抑制[1]。本研究探讨小檗碱对低分化子宫内膜腺癌细胞AN3CA的抑制作用。

1 材料与方法

1.1 材料

细胞系及主要实验试剂：细胞系，低化子宫内

膜癌细胞AN3CA来自山东第一医科大学生命科学研究中心保存；小檗碱，产品编号：S583634，购买自Sigma；MEM培养基，产品编号：31985070，自Gibco购买；胎牛血清，产品编号：10099，自Gibco购买；二甲基亚砜DMSO，产品编号：C6164，自Sigma购买；Tanswell小室，产品编号：CLS3381，自Merck Millipore购买；Matrigel（基质胶），产品编号：114-550，自Merck Millipore购买；Annexin V-FITC/PI 双染细胞凋亡检测试剂盒，产品编号：BB-4101，自贝博生物公司购买。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养及小檗碱配置 人低分化子宫内膜腺癌细胞AN3-CA复苏、培养于MEM培养基中，放置于5%CO2恒温培养箱中培养，温度37℃，2～3 d传代1次，每2天换液。细胞进入对数生长期后，进行后续实验。将小檗碱溶于二甲基亚砜（DMSO），配为1 mmol/L的溶液，实验使用时用细胞培养基稀释小檗碱至最终浓度分别为10、20、40、80 μmol/L，取不加小檗碱的培养基为阴性对照（0μmol/L）[2]。所有实验均重复三次。

1.2.2 MTT法检测细胞增殖 AN3CA细胞复苏，接种于96孔板，浓度调整为：细胞液100 μl，含5×103细胞。用梯度浓度0、20、40、80μmol/L小檗碱作用24、48、72 h后，加入MTT液，浓度5 mg/ml，继续培养细胞4 h，吸上清，加入DMSO溶解。采用550 nm波长，测定OD（光密度）值，应用如下公式：（1-实验组OD值/对照组OD值）×100%，计算细胞生长抑制率。SPSS计算50%抑制浓度（IC50）。

1.2.3 平板克隆形成实验 取400个对数生长期AN3CA细胞，接种至10 cm细胞培养皿，培养过夜，以0、20、40 μmol/L小檗碱作用48 h后换液，培养箱内培养14 d后倒掉培养基，固定、染色，观察并记录直径＞10 mm的细胞克隆数目。

1.2.4 Transwell实验检测细胞侵袭能力 血清培养基饥饿AN3CA细胞12 h，以0、20、40 μmol/L小檗碱作用48 h后换液，取Transwell小室，悬浮细胞，上室细胞培养基中不加血清，密度约为1.5×105/ml（细胞液200 μL），下室加入600 μL培养基（含有10%的胎牛血清）。每组设置3个复孔，置于细胞培养箱培养24 h。培养24 h后，取出小室，用棉签轻轻除去滤膜上层未侵袭的细胞，PBS冲洗、固定、染色，显微镜下观察侵袭细胞的数目。

1.2.5 流式细胞术检测细胞凋亡 对数生长期的AN3CA细胞，接种于6孔按板中，隔日换液，加入分别含0、20、40、80 μmol/L小檗碱浓度的培养基作用48 h，以3孔作为1组，继续培养48 h。收集细胞，计数，100 μL缓冲液悬液，避光，加入5 μl Annexin PE，5 μl PI，室温孵育，15 min，筛网过滤，上流式细胞仪，检测细胞凋亡。

1.3 统计学方法

本研究数据应用SPSS 25.0统计学软件进行统计分析，计量资料以均数±标准差（±s）表示，组间比较采用t检验。P＜ 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 小檗碱对AN3CA细胞形态的影响

正常AN3CA 细胞形态规整、饱满，多边形，细胞胞质丰富，贴壁紧密。应用小檗碱作用后且随作用浓度及作用时间逐渐增加，细胞体积开始逐渐缩小，变圆，细胞皱缩，细胞内出现空泡，细胞结构破坏，贴壁不紧密同时排列稀疏。见图1A。

2.2 MTT法检测小檗碱对 AN3CA 细胞增殖的影响

梯度浓度小檗碱作用AN3CA 细胞24、48、72 h，分别测550 nm波长处测定OD值。按（实验 组OD值/对 照 组OD值）×100%计 算 细 胞存活率（%）。相对于对照组，梯度浓度10、20、40、80 μmol/L小檗碱作用细胞24 h后，细胞存活 率 分 别 为（95.27±3.32）%、（89.13±0.76）%、（87.84±2.37）%、（74.39±1.71）%。作用48 h后，细胞存活率分别为（77.48±3.83）%、（70.45±1.36）%、（48.76±3.15）%、（41.84±5.14）%。作用72 h后，细胞存活率分别为（63.47±5.55）%、（47.38±3.147）%、（26.37±1.19）%、（19.48±1.34）%。10 μmmol /L小檗碱作用细胞24 h后所测得细胞OD值与对照组比较，差异有统计学意义（P＜ 0.05），其余各浓度组与对照组比较，差异有统计学意义（P均＜0.01）。10、20、40、80 μmol/L小 檗 碱 作 用 细 胞48 h及72 h后所测得细胞OD值与同作用时间对照组比较，差异有统计学意义（P均＜0.01）。小檗碱以浓度和时间依赖抑制AN3CA细胞生长。见图1B。SPSS25.0计算出小檗碱计算出72 h50%抑制浓度13.5 μmol/L。选择20、40 μmol/L小檗碱进行后续实验。

2.3 平板克隆形成检测小檗碱对AN3CA细胞增殖的影响

取0、20、40μmol/L小檗碱作用AN3CA细胞后，细胞形成克隆数分别为（761.7±45.7）、（584.6±58.2）、（207.0±36.0）。20、40 μmol/L组分别与0 μmol/L组间比较，差异有统计学意义（P＜ 0.05）。小檗碱剂量越高对AN3CA细胞克隆形成抑制越强。见图1C、1D。

图1 小檗碱抑制AN3CA细胞增殖能力（A、B）及克隆形成能力（C、D）

2.4 Transwell 检测细胞体外侵袭能力

取0、20、40 μmol/L小 檗 碱 作 用AN3CA细胞后，细胞的穿膜细胞数分别为（139.7±11.1）、（110.0±5.1）、（56.7±6.5），20、40 μmol/l组 分 别 与0 μmol/L组间比较，差异均有统计学意义（P＜ 0.05）。随着小檗碱浓度的增加，其对AN3CA 细胞体外侵袭的抑制能力增强。见图2。

图2 小檗碱抑制AN3CA细胞侵袭能力

2.5 小檗碱对 AN3CA 细胞凋亡的影响

0、20、40μmol/L小檗碱作用AN3CA细胞后，人子宫内膜腺癌AN3CA细胞24 h后AN3CA细胞总凋亡率分别为（10.37±1.16）%、（46.91±2.48）%、（54.73±1.39）%，20、40 μmol/L组分别与0μmol/L组比较，差异有统计学意义（P＜ 0.05）。见图3。

图3 小檗碱促进AN3CA细胞凋亡

3 讨论

子宫内膜癌在我国发病率仅次于宫颈癌，今年我国新发病例8.5万余例，导致1.7万余人死亡[3]。美国发病率已超越宫颈癌，位居妇科恶性肿瘤首位，2018年新发子宫内膜癌约6.6万例，导致1.2万余人病死，病死率占同年恶性肿瘤病死患者3%[4]。如何更好治疗低分化、晚期子宫内膜癌是妇科肿瘤的研究热点。

多种肿瘤研究中，小檗碱表现出肿瘤抑制作用[5]。其机制可能有：①导致细胞周期停滞；②促进细胞凋亡；③引起细胞自噬抑制端粒酶活性[1]；④与微RNA相互作用来抑制细胞增殖[6]；⑤抑制EMT[7]；⑥下调转移相关蛋白和信号通路的表达等[8]。与小檗碱发挥作用相关信号通路有①AMP活化蛋白激酶；②丝裂原活化蛋白激酶；③蛋白激酶B通路等[9]。

在妇科恶性肿瘤中研究发现，随浓度增加，小檗碱呈现抑制人宫颈癌细胞生长抑制作用的增强；还能抑制宫颈癌细胞迁移和侵袭，作用后BAX、Caspase-3表达升高，而Bcl-2、KRT17表达降低[10]。HPV为宫颈癌发生的主要致病因素，约有85%的宫颈癌导致的病死发生在发展中国家[11-12]。研究提示小檗碱有望成为治疗HPV感染相关的宫颈癌的潜在药物[13]。有研究发现，小檗碱通过下调EGFR-ErbB2/PI3K/Akt信号通路，抑制EGFR和ErbB2下游靶点cyclin D1、MMPs和VEGF的激活及通过泛素介导的蛋白酶体降解诱导ErbB2耗竭两种途径降低了卵巢癌细胞的活动能力和侵袭性[14]。小檗碱还可以通过抑制化疗激活的GLI1/BMI1信号通路逆转EMT和肿瘤迁移，这提示小檗碱可与化疗药物联合使用，以预防卵巢癌化疗期间的转移[15]。

本研究对不同浓度小檗碱对低分化子宫内膜癌AN3CA细胞生长的影响，MTT显示小檗碱可显著抑制子宫内膜癌细胞生长，呈时间-剂量依赖性。细胞集落形成实验进一步检测小檗碱对AN3CA细胞增殖的抑制作用，研究显示经小檗碱作用后细胞克隆形成数目明显减少，差异有统计学意义（P＜ 0.05）。Transwell侵袭实验中，检测显示药物作用后细胞侵袭穿过小室基底膜细胞数目明显减少，差异有统计学意义（P＜ 0.05）。以上结果提示小檗碱抑制了AN3CA细胞生长，这些结果与在其他恶性肿瘤研究中研究结果一致，提示小檗碱能有效抑制低分化子宫内膜腺癌细胞AN3CA细胞增殖及侵袭能力。进一步探讨其对小檗碱凋亡能力的影响，行流式细胞术检测，结果显示小檗碱能明显促进AN3CA细胞凋亡，小檗碱作用细胞后细胞早期凋亡、晚期凋亡及总凋亡率均增加。以上结果均提示小檗碱对低分化子宫内膜癌细胞的抑制作用。

上述研究结果提示小檗碱能抑制低分化子宫内膜腺癌AN3CA细胞增殖及侵袭能力，促进其凋亡，这可能为中药小檗碱应用于子宫内膜癌中的治疗提供一定理论依据，但其确切作用机制不明，仍需进一步研究，同时需体内试验进行验证，其临床中的具体应用仍需进一步讨论。