牛蒡子苷元对弹性蛋白酶的抑制作用研究

付金凤，姚红柳，李美霖，尹广婷，赵彬旭，崔晋玮，苏丽红

(1.长春师范大学，吉林 长春130032；2.中国医科大学，辽宁 沈阳 110122)

弹性蛋白酶(PPE)是一种蛋白水解酶，可以水解弹性蛋白、血浆蛋白等，是肺部重要组成部分[1]，还可以诱导上皮细胞释放炎症因子，与肺组织损伤关系密切，其过度表达会引发急性肺损伤、呼吸窘迫综合征等炎症性疾病[2]。弹性蛋白酶已成为抗炎药物筛选的较佳酶靶[3]。

牛蒡子苷元(Arc)是一种苯丙素二苯基丁内酯木脂素[4]，结构如图1，具有抗炎[5]、抗病毒等药理作用[6]。SHI等[7]发现牛蒡子苷元可减轻由脂多糖(LPS)引起的急性肺损伤；ZHANG等[8]发现牛蒡子苷元(50 mg/kg)可显著抑制LPS引起的肺组织炎症反应。对比几种天然二苯基丁内酯类木脂素对弹性蛋白酶的抑制作用[9]，选取活性最好的牛蒡子苷元进一步研究。

图1 牛蒡子苷元结构

为新型弹性蛋白酶抑制剂的研究提供参考，本文以牛蒡子苷元作为研究对象，通过酶靶活性筛选模型，运用酶促反应动力学研究牛蒡子苷元对弹性蛋白酶的抑制作用，包括半数抑制浓度(IC50)、抑制常数(Ki)以及抑制类型；通过紫外-可见吸收光谱、圆二色光谱、红外光谱研究了Arc对PPE构象的影响；通过分子对接模拟Arc与PPE的相互作用，分析了其作用力类型以及作用位点。

1 实验部分

1.1 试剂与仪器

牛蒡子苷元；Tris-HCl缓冲液；弹性蛋白酶(PPE,EC3.4.21.36)(Sigma公司)；N-Suc-Ala-Ala-Ala-pNA(Sigma公司)。

多功能读板机 FlexStation3(MolecularDevices公司)；96孔聚苯乙烯透明平底微孔板(COSTAR公司)；Cary 300紫外可见分光光度计(美国Agilent Technologies公司)；MOS-500圆二色谱仪(法国Biologic)；Nicolet IS50傅里叶变换红外光谱仪(美国Thermo)。

1.2 实验步骤

1.2.1 IC50值测定

弹性蛋白酶、底物、抑制剂均用Tris-HCl缓冲液配制。测定时在96孔板反应，每孔中加入1 mmol/L的底物30 μL，1 μmol/L的弹性蛋白酶溶液30 μL，2 mmol/L的牛蒡子苷元溶液分别加0、20、40、50、60、80、100、120、140 μL，用缓冲液补充总体积为200 μL，以缓冲溶液为空白，用酶标仪于波长405 nm计时测定303 K温度下反应的吸收值，并计算其抑制率。做三次平行实验。

1.2.2 抑制常数Ki

测定时在96孔板反应，每孔中加入1 μmol/L的弹性蛋白酶溶液30 μL，与0、50、100、140 μL的2 mmol/L牛蒡子苷元溶液，以及浓度分别为0.10、0.25、0.50、0.80、1.00 mmol/L的30 μL底物反应，用缓冲液补充总体积为200 μL，以缓冲溶液为空白，用酶标仪于波长405 nm计时测定303 K温度下的酶解反应速率。重复三次平行实验。

1.2.3 紫外-可见吸收光谱

分别配制5×10-6mol/L PPE、2×10-5mol/L Arc、5×10-6～2×10-5mol/L Arc-PPE溶液，摇匀，室温下静置5 min。选1 cm吸收池，量取3 mL待测液体，用Tris-HCl缓冲溶液作空白参比，扫描并记录200～500 nm范围的紫外可见吸收光谱。

1.2.4 圆二色光谱

用PBS分别配置5×10-6mol/L的PPE、5×10-6～1×10-5mol/L的Arc-PPE溶液待测。选用1 mm的石英吸收池，移取300 μL待测液体扫描波长范围设置为190～250 nm，狭缝宽度设置为2 nm，时间为1 s，以PBS缓冲溶液为背景，做三组平行实验。

1.2.5 红外光谱

采用压片法，扫描PPE、Arc-PPE在400～4 000 cm-1波数范围的红外光谱。

1.2.6 分子对接模拟

通过Schrodinger软件中的“Protein Preparation Wizard”程序对蛋白进行加氢以及对蛋白晶体结构中非完整氨基酸残基进行矫正，同时在Chem Bio 3D Ultra 14.0软件中对PPE及Arc三维结构进行能量最优化。最后使用Auto Dock 4.2.6软件进行分子对接。

2 结果与讨论

2.1 半数抑制浓度IC50值

半数抑制浓度(IC50)可以体现牛蒡子苷元对弹性蛋白酶的抑制作用，IC50即当对弹性蛋白酶的抑制率为50%时牛蒡苷元的浓度。以牛蒡子苷元的浓度为横坐标，抑制率为纵坐标，绘制曲线，结果见图2。抑制率随着牛蒡子苷元浓度的增加而增加，趋势先陡后趋于平缓，抑制率达到50%时牛蒡子苷元浓度为1.25 mmol/L，即IC50=1.25 mmol/L。

图2 牛蒡苷元对弹性蛋白酶的百分抑制率

2.2 抑制常数Ki

图3 Lineweaver-Burk曲线图

计算得抑制常数Ki= 6.19×10-4mol/L。

2.3 紫外-可见吸收光谱分析

PPE的紫外吸收光谱中280 nm附近的吸收峰是由Tyr残基中共轭双键及Trp残基的吲哚环所贡献，但由于Trp的紫外吸收远远大于Tyr，所以主要是Trp的贡献[12]。图4为PPE、Arc、Arc-PPE的紫外吸收光谱，且APPE+AArc≠AArc-PPE。PPE在280 nm附近出现的吸收峰在加入Arc后发生红移，表明Arc与弹性蛋白酶结合改变了构象。

(a)PPE；(b)Arc；(c)Arc-PPE图4 PPE、Arc、Arc-PPE的紫外吸收光谱图

2.4 圆二色光谱分析

圆二色光谱在远紫外区(185～245 nm)的特征峰可以判定蛋白质多肽主链构象变化，研究生色团的微环境[13]。图5分别表示PPE、PPE-Arc的圆二色光谱图，从图中可以看出，牛蒡子苷元加入使208 nm、200 nm附近的负带增加，说明α-螺旋结构所占比例增加，通过圆二色光谱仪所带计算软件Dicroport计算，弹性蛋白酶中α-螺旋结构由6.909%增加至7.864%。牛蒡子苷元的加入使弹性蛋白酶的二级构象发生了变化。

(a)PPE；(b)Arc-PPE图5 PPE、Arc-PPE圆二色光谱

2.5 傅里叶变换红外光谱分析

(a)PPE；(b)Arc-PPE图6 PPE和Arc-PPE的红外光谱

2.6 分子对接模拟

分子对接模拟结果如图7所示，软件计算最佳结合能为-30.932 kJ/mol。牛蒡子苷元具有二苄基丁内酯结构，其中五元内酯的羰基氧与弹性蛋白酶中缬氨酸(VAL99)产生了氢键作用力；苯环上甲氧基与苏氨酸(THR175)产生了氢键作用力，苯环与精氨酸(ARG217A)产生了π-阳离子作用，并且与亮氨酸(LEU218)、赖氨酸(LYS224)、丝氨酸(SER217)、缬氨酸(VAL216)(VAL99)、精氨酸(ARG217A)、苯丙氨酸(PHE215)、组氨酸(HIS57)、色氨酸(TRP1729)、天冬氨酸(ASP97)有范德华作用；与苏氨酸(THR175)(THR96)、丙氨酸(ALA99)有静电作用；与精氨酸(ARG217A)、苏氨酸(THR175A)、缬氨酸(VAL99)、色氨酸(TRP172)有疏水作用。牛蒡子苷元的二苄基丁内酯结构可以与弹性蛋白酶以π-阳离子作用、氢键作用、范德华作用、疏水作用以及静电作用紧密结合。

图7 Arc-PPE分子对接模拟

3 结论

以上研究表明，牛蒡子苷元对弹性蛋白酶有抑制作用，其抑制类型为竞争性抑制，半数抑制浓度IC50= 1.25 mmol/L，抑制常数Ki= 6.19×10-4mol/L，与目前临床上使用的弹性蛋白酶抑制剂——西维来司钠(Ki=2×10-4mol/L)的Ki在同一个数量级。红外光谱、紫外光谱均表明，牛蒡子苷元与弹性蛋白酶产生了相互作用，并改变了弹性蛋白酶二级结构。圆二色光谱表明牛蒡子苷元使弹性蛋白酶中α-螺旋所占比例增加，无规则卷曲所占比例增加。结合分子对接结果，牛蒡子苷元与弹性蛋白酶作用存在π-阳离子、氢键作用、范德华作用、疏水作用以及静电作用等多种作用力，两者可以较好地结合，干扰了弹性蛋白酶对底物的分解，从而降低酶的活性。二苯基丁内酯结构中五元内酯的羰基氧结构、苯环及甲氧基结构均是很好的作用位点。以上研究可以为新的弹性蛋白酶抑制剂的设计、合成提供新的思路。