血液中鸟氨酸在乳腺癌及乳腺良性肿瘤患者中表达差异及临床意义研究

种一然，李锦成，陶维

（锦州医科大学附属第一医院1.外科学；2.乳腺外科，辽宁 锦州 121000）

乳腺癌仍然是世界范围内女性最常见的恶性肿瘤，也是主要的公共卫生问题。在美国，2012-2016 年乳腺癌的年龄标准化发病率为每10 万女性中有126.8 例；2013-2017 年乳腺癌年龄标准化死亡率为每10 万女性中20.3 人［1］。与美国相比，中国乳腺癌的发病率相对较低，其年龄标准化发病率约为29/10 万名女性。2011 年，中国女性因乳腺癌导致的年龄标准化死亡率为每10 万人6.6人［2］。虽然中国乳腺癌发病率较低，但预计2021年35～69 岁女性中乳腺癌年龄标准化发病率将提高至每10 万人85 人［3］。随着乳腺癌发病率的增加，由乳腺癌引起的年龄标准化死亡率也可能会出现相同的趋势［4］。为了更有效地预防和治疗乳腺癌，寻找新的乳腺癌风险评估和治疗代谢物是非常有必要的。鸟氨酸是一种非必需氨基酸；它参与许多代谢途径［5］。体内外数据发现，鸟氨酸及其相关代谢产物（即氨和聚乙烯甲胺）在癌细胞活动和肿瘤发生中起作用［5-8］。然而，目前还不清楚鸟氨酸是否与人类乳腺癌的发生有关。考虑到乳腺癌的严重后果，了解这种关系可能有助于改善目前的乳腺癌风险评估并制定新的治疗策略。因此，本实验研究了鸟氨酸水平与女性乳腺癌之间的关系。

1 资料与对象

1.1 研究设定和研究对象

本研究的所有参与者均来自于2017 至2018年间于锦州医科大学附属第一医院住院患者，共计407 例。本研究给参与者根据以下条件分成了实验组和对照组的病例：①女性；②有效的血液鸟氨酸分析；③明确病理诊断为乳腺癌或非乳腺癌；④有完整真实有效的因变量数据（如年龄、体重、身高、月经初潮年龄、高血压病史、Ⅱ型糖尿病史、既往癌症史、吸烟史、饮酒史、癌症家族史和绝经状态）。该研究得到了锦州医科大学附属第一医院伦理审查委员会的批准。保证了本研究所有参与者的知情权，并取得了参与者的书面知情同意。

1.2 病例和控制的评估

本研究根据病理科提供的术后病理检查确定所有女性患者为乳腺癌病例或者是乳腺良性肿瘤病例。乳腺癌诊断的分期是由美国肿瘤联合委员会制定的肿瘤转移（TNM）分期法［9］。乳腺癌肿瘤组织学分级根据中国最新乳腺癌指南进行分级［10］。乳腺癌的分子分型包括：HER-2 扩增型、Luminal A、Luminal B 及三阴型［10］。同时这些病例也通过既定公认的方法进行病理检查、临床检查、病史询问和其他检查（即血液常规及传染病检查）［11］。在确定病例组和对照组之后，分别按年龄将实验组与对照组进行匹配（±1 年），比例为1∶1。

1.3 因变量的确定

这项研究的因变量包括人口统计学方面因素［身体质量指数（BMI）］、生活方式方面因素（吸烟和饮酒情况）、既往史（月经初潮年龄、高血压史、是否为绝经状态、Ⅱ型糖尿病史，自身既往肿瘤史和家族癌症史）。BMI 中身高体重的测定方法：参与者穿着轻便的衣物光着脚站在电子秤上测量体重（精确到0.1 kg）。测量身高利用的是壁挂式视距仪（精确到0.1 cm）。BMI 的计算公式为：体重（kg）/高度的平方（m2）。按照最新指南公认的高血压定义为收缩压≥140 mmHg（1 mmHg=0.133 kPa）或舒张压≥90 mmHg。根据公认的方法评估Ⅱ型糖尿病的诊断，即美国糖尿病协会更新的糖尿病患者医疗标准［12］。从临床病历记录中提取月经初潮年龄、既往癌症史、吸烟史、饮酒史、癌症家族史和是否处于绝经状态。

1.4 血液收集及处理

在患者进行任何临床操作及治疗前，用真空吸尘管收集实验组和对照组的空腹血样（空腹时间＞8 h）。利用干燥的血液滤纸，从收集的空腹血液样本中提取干燥的血液斑点样本。全部干燥的血斑样本在-80℃保留，直到检测完成。

1.5 鸟氨酸测定

鸟氨酸水平的测量是基于既定的方法［13］。在圆形滤纸片上用打孔器打出直径为3 mm 的血片，之后将该滤纸片置于96 孔的过滤板中，每个孔中加入含内标的无水甲醇，再将孔板置于振荡器内，于室温下振荡20 min，用孔板离心机Rotor3以2 000 r/min×2 min 的程序进行离心，上层样品板中的提取液通过滤膜过滤并收集于下层样品板中。离心后将基层样品板于氮气中吹干。吹干后，每个孔中都加入衍生剂并密封，之后于65°C 的环境下孵育15 min 后进行衍生化。衍生后的溶液，在氮气中吹干，流动相复溶。最后，采用液相色谱：LC20A（Shimadzu）和质谱：SCIEX API 3200MD（AB）这二种仪器进行检测，该平台能够灵敏地检测生物分子［14］。

1.6 统计学方法

研究采用SPSS24.0 和R 基础统计软件（版本3.5.3）分析数据。计数资料采用百分率（%）表示，组间比较运用χ2检验或Fisher 精确概率法。对计量资料进行正态性检验，符合正态分布的采用均数±标准差（）表示，组间比较采用两独立样本t检验；不符合正态分布的计量资料以中位数（四分位间距）［M（P25,P75）］表示，采用Mann-WhitneyU检验。采用逐步法进行二元Logistic 回归。P＜0.05 为差异有统计学意义。

本研究使用非条件Logistic 回归分析来估计比值比（ORs）和相应的95%置信区间（CIs），以确定鸟氨酸水平增加1 个标准差（SD）与乳腺癌之间的关系。鸟氨酸水平被转换成对数模式来近似正态分布。最后的模型根据个人肿瘤史进行了调整。还考虑了纳入最终模型的下列因变量：BMI、高血压史、Ⅱ型糖尿病史、绝经状态、吸烟史、月经初潮年龄、饮酒史与家族癌症史。但是，在乳腺癌的双变量分析中，均未达到P＜0.10 的标准，因此在最终的调整中被排除在外。本研究还使用了非条件Logistic 回归分析模型来测试不同水平的鸟氨酸（四分位数）与乳腺癌之间的关系。根据鸟氨酸分布分为四分位数（百分比25、50 和75）。最后模型又根据自身肿瘤史进行了调整。

在非条件Logistic 回归分析模型中，按照肿瘤临床分期和肿瘤组织学分级进行亚组分析，以确定鸟氨酸（每增加1 个SD）和乳腺癌之间的关系是否随临床分期和肿瘤分级而改变。采用多元线性回归模型检验病例间临床分期与肿瘤组织学分级的相关性趋势，其中以鸟氨酸的连续测量为自变量，临床分期与肿瘤组织学分级为因变量。为了确定乳腺癌的分子亚型是否影响这种关联，进行了非条件多变量Logistic 回归分析，以估计鸟氨酸水平（每增加1 个SD）与乳腺癌分子亚型之间的关联。用非条件Logistic 回归分析模型中病例间的相互作用项［分子亚型*鸟氨酸水平（每增加1个SD）］来测试分子亚型与鸟氨酸水平之间的相互作用P。

2 结果

这项研究包括407 例乳腺癌病例和407 例乳腺良性肿瘤病例，共814 例病例进行了对比。对照组大多数（95.0%）患者为良性乳腺肿块，其余为乳腺炎患者（3.1%），副乳腺良性肿块（0.7%），乳腺增生（0.5%），腋窝良性肿块（0.3%），胸壁良性肿块（0.3%）或乳腺脂肪瘤（0.1%）。

实验组平均年龄为（48.3±7.6）岁，对照组平均年龄为（48.4±7.7）岁。实验组个人肿瘤史的患者比例高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）。实验组年龄、BMI、高血压史、Ⅱ型糖尿病史、绝经状态、吸烟史、月经初潮年龄、饮酒史与家族癌症史等与对照组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。见表1。鸟氨酸四分位数与BMI 呈负相关，本实验研究的其他特征（年龄、初潮年龄、高血压史、Ⅱ型糖尿病史、癌症病史、吸烟史、饮酒史、癌症家族史和绝经状态）与鸟氨酸水平无相关性。

表1 乳腺癌病例和乳腺良性肿瘤病例对照的特点

鸟氨酸水平每增加一个SD，乳腺癌的发病率就降低一个比率（=0.76,95%CI：0.65～0.89）。见表2。在调整绝经后状态后，显著的负相关仍然存在（=0.76,95%CI：0.65～0.89），随着每SD鸟氨酸水平的增加，乳腺癌风险降低27%。当鸟氨酸水平被划分为四分位数时，与鸟氨酸水平低四分位数的女性相比，高鸟氨酸水平四分位数的女性患乳腺癌的风险也更低（调整后=0.76,95%CI：0.51～1.13）。鸟氨酸水平与乳腺癌之间的关系和肿瘤临床分期及肿瘤组织学分级无关（P＞0.05），见表3、表4。乳腺癌分子亚型间无相互作用（P=0.93），见表5。

表2 鸟氨酸与乳腺癌相关性的多变量Logistic 回归

表3 鸟氨酸水平与肿瘤临床分期关系

表4 鸟氨酸水平与肿瘤组织学分级关系

表5 鸟氨酸水平与肿瘤分子分型关系

3 结论

鸟氨酸程度越高，女性患乳腺癌的风险就越低。鸟氨酸含量高是乳腺癌的潜在保护因素。通过本研究可以发现，鸟氨酸水平与女性乳腺癌之间存在显着的负相关关系，这可能会对乳腺癌评估和治疗方法产生重大的公共卫生影响。未来的研究将证实本实验的结果。

在这项年龄匹配的女性病例对照研究中，观察到鸟氨酸水平与乳腺癌之间在统计学上呈显著的负相关。这种关联不随临床分期和肿瘤分级而改变，也不受分子亚型的影响。考虑到这是第一次人类研究，表明鸟氨酸水平与乳腺癌之间的潜在保护关系，未来的流行病学研究将证实这个实验的研究结果。

鸟氨酸与乳腺癌之间关系的潜在机制仍有争议。一方面，鸟氨酸水平升高可以通过尿素循环减少氨的生成及其相关的氧化应激反应［15-16］，从而起到保护作用。因为较低的氧化应激水平与有较低的乳腺癌风险［17］。另一方面，鸟氨酸是促进癌症进展的鸟氨酸脱羧酶（ODC）生产多胺的底物［5，7，18-19］。虽然鸟氨酸参与肿瘤发展的生物学机制是相互矛盾的，但根据本实验的发现，前者可能是主要的作用机制。

本研究具有一定的临床和公共卫生意义。目前，左旋鸟氨酸及其与左旋天冬氨酸的混合物是降低急性肝功能衰竭和肝性脑病患者氨水平相对安全有效的药物［15-16，20-21］。本研究表明鸟氨酸对乳腺癌患者的治疗可能有额外的疗效。此外，如果此发现可以通过前瞻性研究得到重复，那么鸟氨酸水平可能成为未来预测乳腺癌事件的一个独立因素。乳腺癌仍然是女性的一个主要公共卫生问题。然而，只有少数乳腺癌的危险因素可以有效地预防和并以此治疗乳腺癌。此研究结果对于乳腺癌的治疗和预测提供了一个潜在的新目标。

在解释此实验的结果之前，应该认识到几个局限性。首先，由于这是一项病例对照研究，无法对鸟氨酸水平与乳腺癌发病率之间的关系做出因果推断。其次，一些乳腺癌的危险因素，包括体育活动，激素替代疗法，己烯雌酚的使用，是不控制的。第三，本研究的大多数对照组（95%）为良性乳腺肿块。使用健康的对照组是否会产生相似的结果还不清楚。最后，因为这项研究是基于医院的数据进行的，它应该被谨慎的看待，因为此实验的发现可能不能推广到一般人群。

总之，高水平的鸟氨酸是乳腺癌的一个潜在的保护因素。人们对鸟氨酸水平与女性乳腺癌之间关系的认识得到了拓展。