高效液相色谱柱前衍生法测定水产品中的游离甘氨酸
2023-01-12黄柳霞郑陆红张慧琼林洁娜罗雪燕
黄柳霞，郑陆红，张慧琼，林洁娜，罗雪燕
（1.广东省食品工业公共实验室，广东 广州 511446；2.广东省食品工业研究所有限公司，广东 广州 511446；3.广东省质量监督食品检验站，广东 广州 511446）
甘氨酸（Gly），又名氨基乙酸，是一种非必需氨基酸，化学式为C2H5NO2[1]。固态的甘氨酸为白色至灰白色结晶粉末，无臭，无毒，在水中易溶，微溶于乙醇、醚等[2]。甘氨酸在食品、农业、医药等领域被广泛应用[3]。甘氨酸具有呈味、抑菌、螯合、防氧化作用，在食品中起改善味质、防止油脂氧化、调和咸味、增加甜味的功能。近年来甘氨酸又用作氨基酸农药，1973年德国化学家斯密司制成的N-磷酸甲酯甘氨酸是一种有效的除草剂，每10 000 m2使用1.5 kg即可消灭杂草[4]。在医药方面，甘氨酸与阿斯匹林、扑热息痛等反应制得的药物不仅可提高药物的溶解度增加药效，还有效抑制了药物产生的副作用[5]。目前，现代社会对甘氨酸的用量需求不断增大，寻找甘氨酸的合适来源意义重大。甘氨酸的工业化生产方法主要为氯乙酸氨解法和施特雷克法2种，中国主要采用氯乙酸氨解法进行生产甘氨酸[6]，但工业生产方法往往成本消耗较高，提取率不理想，易产生污染物等，故寻找天然游离甘氨酸资源是一个有效的解决途径。新鲜水产品中氨基酸类物质含量丰富，游离甘氨酸在各种新鲜水产品中含量不同。目前关于水产品中游离甘氨酸的测定鲜见报道，常见的检测方法有离子交换色谱法、氨基酸法、高效液相色谱-荧光检测法、液相色谱串联质谱法等[7]，较少见使用高效液相色谱-二极阵列管检测法。同时常见的柱前衍生法使用邻苯二甲醛作为衍生剂，此方法虽衍生时间短，但衍生后物质极其不稳定[8]，无法很好地准确测定目标物。本文试图通过采用丹磺酰氯作为衍生剂[9]，采用柱前衍生的方法对水产品中的游离甘氨酸进行衍生，运用高效液相色谱-二极管阵列检测器检测，同步结合查看光谱进行定性定量。本文采用该法拟直接检测各类新鲜水产品游离甘氨酸的含量，为寻找含量丰富的甘氨酸资源及甘氨酸的利用提供了方向。
1 材料与方法
1.1 材料与设备
甘氨酸标准物质（纯度99.8%），上海安谱科学仪器有限公司；乙腈（色谱纯），广州市泛宏贸易有限公司；丹磺酰氯（色谱纯），上海安谱科学仪器有限公司；乙酸锌、亚铁氰化钾、浓盐酸、碳酸钠、乙酸钠、乙酸铵、盐酸甲胺均为分析纯，广州市广联津化工有限公司；水为符合GB/T 6682规定的一级水。
本实验所用的新鲜水产品（鱼类、贝类、虾类）均从广州水产市场采购。
1260 LC高效液相色谱仪（带二极管阵列检测器），安捷伦科技有限公司；LA8080氨基酸分析仪，HITACHI；智能型数控超声清洗器，昆山市超声仪器设备有限公司；温度计，翼州市耀华器械仪表厂。
1.2 试剂的配制
1.2.1 15 g/100 mL亚铁氰化钾溶液
称取15 g亚铁氰化钾，加水溶解，用水定容至100 mL。
1.2.2 30 g/100 mL乙酸锌溶液
称取30 g乙酸锌，加水溶解，用水定容至100 mL。
1.2.3 1 mol/L盐酸溶液
吸取9 mL盐酸，用水稀释至100 mL。
1.2.4 碳酸钠缓冲溶液（pH = 9.5）（80 mmol/L）
称取0.424 g无水碳酸钠，加40 mL水溶解，用1 mol/L盐酸溶液调pH至9.5，用水定容至50 mL。
1.2.5 1.5 mg/mL丹磺酰氯溶液
称取0.15 g丹磺酰氯溶于100 mL乙腈中。
1.2.6 2 g/100 mL盐酸甲胺溶液
称取0.2 g盐酸甲胺，加水稀释至10 mL。
1.2.7 0.01 mol/L乙酸钠溶液（pH = 4.2）称取0.820 g乙酸钠，加800mL水溶解稀释，加乙酸调pH至4.2，加水定至1 L，混匀后过0.45µm滤膜。
1.2.8 0.01 mol/L乙酸钠溶液（pH = 7）
称取0.820 g乙酸钠，加800 mL水溶解稀释，加水定至1 L，混匀后过0.45µm滤膜，测得pH为7。
1.2.9 甘氨酸标准储备溶液
准确称取甘氨酸0.100 0 g 至100 mL 容量瓶中，用水溶解并定容，即配制成1 000 µg/mL 的甘氨酸储备液。
1.2.10 甘氨酸标准使用溶液
将甘氨酸储备液用水稀释至浓度为1、5、10、20、50µg/mL的标准使用液。
1.3 实验方法
1.3.1 实验原理样品中游离甘氨酸经水提取、乙酸锌溶液和亚铁氰化钾溶液沉淀蛋白后，样液经丹磺酰氯衍生，其衍生物经高效液相色谱仪分离，用二极阵列管检测器检测。
1.3.2 试样提取
准确称取0.5～2.0 g 试样于三角锥形瓶，加入40 mL 40 ℃水，涡旋混匀1 min 使试样分散，40 ℃超声20 min，冷却至室温后，分别加入1 mL乙酸锌溶液和1 mL亚铁氰化钾溶液，转入100 mL容量瓶，加水定容至刻度，混匀，样液8 000 r/min离心5 min，上清液待用（注意：当样品含量过高时，需在衍生前进行适当地稀释处理后再进行衍生操作，避免衍生不完全）。
1.3.3 衍生处理
分别取1 mL样液和1 mL各标准溶液至10 mL比色管，加入1 mL碳酸钠缓冲液，1 mL丹磺酰氯溶液，充分混匀，室温下避光衍生2 h后加入0.1 mL盐酸甲胺溶液混匀，终止反应。样液经0.22µm有机滤膜过滤，供高效液相色谱仪测定。
1.3.4 标样或样品比对处理
标样或样品在不同的pH流动相、波长、提取温度、超声时间、称量质量、仪器比对处理方法如下。
不同pH流动相比对处理：将标准使用溶液（1.2.10）按1.3.3衍生处理后分别通过1.3.5的流动相1、2（详见1.3.5），其他条件同1.3.5，进行上机比对，同时样品按1.3.2 和1.3.3 处理后，通过流动相1，其他条件同1.3.5，上机比对。
波长比对：将标准使用溶液（1.2.10）按1.3.3衍生处理后分别设定检测波长为254、300、330 nm，其他条件同1.3.5，上机测定。
提取温度比对：同一样品分别在不同超声温度（30、40、50、60 ℃）下进行提取，其他前处理条件同1.3.2及1.3.3，然后按1.3.5，进行上机测定。
超声时间比对：同一样品选择在同一提取及超声温度（40 ℃）下进行不同超声时间（10、20、30 min）比对，其他前处理条件同1.3.2及1.3.3，然后按1.3.5进行上机测定。
不同称重质量比对：同一样品分别称取不同梯度质量（0.5、1.0、2.0 g），其他前处理条件同1.3.2及1.3.3，然后按1.3.5进行上机测定。
不同仪器样品结果比对：随机选取水产品中常见的贝类、鱼类、虾试样（1.1），样品按1.3.2处理后样液上氨基酸分析仪，氨基酸分析仪条件参考GB 5009.124-2016[10]。同时取部分样液按1.3.3处理后按1.3.5上高效液相色谱仪上机测定。
1.3.5 高效液相色谱条件
色谱柱：AQ C18 4.6 mm×250 mm，5µm。
流动相1：乙腈+0.01 mol/L乙酸钠溶液（pH=4.2）（1.2.7）=3+7。
流动相2：乙腈+0.01 mol/L乙酸钠溶液（pH=7）（1.2.8）=3+7。
流速：1.0 mL/min。
柱温：30 ℃。进样量：20µL。检测器：二极管阵列检测器。检测波长：254 nm。
1.3.6 标准曲线的绘制
标准样品溶解后，配制一系列不同浓度的标准液，衍生处理后上机测试，计算、绘制标准曲线。
2 结果与分析
2.1 不同pH流动相甘氨酸出峰情况
按1.3.4将标样和样品在不同pH流动相下上机比对（见图1～3）。从图1和图2可看出，当流动相中乙腈的比例保持不变，流动相中的乙酸钠溶液分别在pH 为4.2 和pH 为7，甘氨酸出峰时间对应为8.7 min 和5.8 min，即乙酸钠溶液pH为7时，甘氨酸的出峰时间更早。从图1和图3则可看出，样品也按1.3.5的流动相1条件上机测试，样品中甘氨酸出峰时间8.7 min与标准溶液甘氨酸一样，样品中的甘氨酸可以很好地与杂质峰分离。本实验还比对了当乙腈更换为甲醇时，同样的比例下甘氨酸出峰时间过长，影响检测效率。故本文选择乙腈+0.01 mol/L乙酸钠溶液（pH=4.2）=3+7（1.2.7）为流动相。
图1 流动相pH=4.2甘氨酸标准溶液色谱图Figure 1 Chromatogram of glycine standard solution in mobile phase pH= 4.2
图2 流动相pH=7甘氨酸标准溶液色谱图Figure 2 Chromatogram of glycine standard solution in mobile phase pH= 7
图3 流动相pH=4.2甘氨酸样品色谱图Figure 3 Chromatogram of glycine sample in mobile phase pH= 4.2
2.2 波长比对
甘氨酸标液按1.3.4 处理后，分别设置不同的检测波长，其他同1.3.5。由表1 可知，甘氨酸在不同波长下响应程度不同，当波长设置在300 nm 或330 nm时，甘氨酸的响应偏低，不利于低浓度样品的测定，而在254 nm 波长下有很好的响应，故本实验仪器参数的波长选择254 nm。
表1 不同波长下50 μg/mL甘氨酸标液的响应Table 1 Response of 50 μg/mL glycine standard solution at different wavelengths
2.3 提取温度比对
同一样品分别在不同超声温度（30、40、50、60 ℃）下进行提取，其他前处理条件同1.3.2 及1.3.3。样品甘氨酸的检测结果表明，在提取及超声温度为40 ℃时最佳，故本实验前处理中选择提取溶剂水和超声温度为40 ℃（见表2）。
表2 同一样品不同温度下甘氨酸的检测值Table 2 The detection value of glycine in the same sample at different temperatures
2.4 超声时间比对
同一样品选择在同一提取及超声温度（40 ℃）下进行不同超声时间（10、20、30 min）比对，其他前处理条件同1.3.2及1.3.3。结果发现当超声时间是20 min时，样品中甘氨酸的提取效果更佳（见表3），故本实验前处理选择超声20 min。
表3 同一样品不同超声时间下甘氨酸的检测值Table 3 The detection value of glycine in the same sample with different ultrasonic time
2.5 不同称重质量比对
同一样品分别称取不同梯度质量，按同样的前处理条件（1.3.2 及1.3.3）进行后上机测定，查看其结果比对，结果见表4。样品中甘氨酸的结果相差不大，其相对标准偏差为0.63%。故本文实验样品前处理称量范围选择0.5～2.0 g，若样品含量过低时，可考虑增大样品称重质量，使其浓度范围落在1～50µg/mL范围内。
表4 同一样品不同称重质量下甘氨酸的检测值Table 4 The detection value of glycine under different weights of the same sample
2.6 不同仪器样品结果比对
随机选取水产品中常见的贝类、鱼类、虾试样（1.1）同步进行高效液相色谱仪与氨基酸分析仪测定，其中样品按1.3.2 处理后样液上氨基酸分析仪，氨基酸分析仪条件参考GB 5009.124-2016[10]。从表5 可知，2种仪器甘氨酸的检测值相对偏差均在10%范围内，可见本文的高效液相色谱法可作为日常方法检测的补充方法，其有检测时间更短的优势。
表5 高效液相色谱仪与氨基酸分析仪测定样品甘氨酸的检测值比对Table 5 Comparison of detection values of glycine in samples by highperformance liquid chromatography and amino acid analyzer
2.7 线性范围、加标回收率和检出限
按确定的方法进行测定，以甘氨酸含量为横坐标，以甘氨酸的峰面积为纵坐标，作标准曲线。实验结果表明，甘氨酸在1～50 µg/mL 成线性关系（见表6 及图5），相关系数R= 0.999 99；对水产品样品进行加标，在样品检出量1/2、1、2 倍范围进行加标，回收率为90.4%～101.0%；相关标准偏差（RSD）为2.5%～3.3%，见表7；根据大于3 倍信噪比确定检出限，将样液稀释至1 µg/mL，其信噪比为9.1，得出甘氨酸的检出限为50 mg/kg。该方法方便、灵敏度高、定性定量准确，可很好地实现水产品中游离甘氨酸的测定。
表7 回收率和精密度Table 7 Recovery and precision
图5 甘氨酸标准曲线Figure 5 Glycine standard curve
表6 线性回归方程Table 6 The regression equations
2.8 市售水产品类样品甘氨酸含量普查情况
随机检测了市售常见的鱼类、贝类、虾类新鲜水产品，由图6可知，不同新鲜水产品中甘氨酸的含量均不同，高的约10 000 mg/kg，最低的约60 mg/kg，检测的这几类水产品中，虾类中甘氨酸的含量普遍最丰富，贝类次之，鱼类普遍较低。
图6 市售水产品类样品中甘氨酸含量Figure 6 Glycine content in commercial aquatic product sample
3 结论
本研究结果表明：样品称取0.5～2 g，加40 ℃水，40 ℃超声20 min提取，乙酸锌和亚铁氰化钾溶液沉淀蛋白，样液经丹磺酰氯衍生后，经C18色谱柱，以乙腈+0.01 mol/L乙酸钠溶液（pH=4.2）=3+7（1.2.7）作为流动相进行等度洗脱，检测波长为254 nm，利用高效液相色谱法-二极管阵列器进行测定，外标法定量。甘氨酸出峰时间适宜，可以和其他杂质峰完整分离，并有很好的响应。本方法线性范围为1～50µg/mL，检出限为50 mg/kg，回收率为90.4%～101.0%。本方法方便、快捷、重现性好、分析时间短，能很好地实现水产品中游离甘氨酸的测定。经检测的36 个市售常见的鱼类、贝类、虾类新鲜水产品样，虾类中甘氨酸的含量普遍最丰富，贝类次之，鱼类普遍较低。本文研究一方面可作为氨基酸分析仪法的补充检测方法，有检测时间更短的优势，另一方面为新鲜水产品中丰富的甘氨酸资源的利用提供了相关方向。
