复合水果酵素发酵过程中理化特性及抗氧化活性分析

李悦，张云娟，赵叶，章金龙，宋志姣*

1.保山学院资源环境学院（保山 678000）；2.云南省高校怒江河谷生物质资源高值转化与利用重点试验室（保山 678000）

猕猴桃（Actinidia chinensis Planch）含有丰富的维生素C、果糖、果酸和酚类物质，具有较高的营养价值和药用价值[1]。经常食用猕猴桃，可以降低血液中胆固醇，防治心血管疾病。其所含有的SOD酶，具有出众的抗氧化性能，可以消除皱纹和细纹。此外，猕猴桃中的维生素C和维生素E还能够促进人体对糖分的吸收，提高抵抗力[2]。葡萄（Vitis vinifera L）含有较多葡萄糖、B族维生素、维生素C、矿物质以及多种人体所需的氨基酸。鲜葡萄中的多种果酸有助于消化，黄酮类物质能防止形成胆固醇斑块。此外，葡萄籽中富含的原青花素能清除人体内有毒的自由基，保护人体细胞组织免受自由基的氧化损伤，具有辅助降低心脑血管疾病发生、防辐射、美白祛斑等功效[3]。猕猴桃及葡萄均是进行果蔬深加工的良好原料。

酵素是用一种或多种新鲜水果、蔬菜等为原料，经多种有益微生物发酵的一种含有酶、矿物质和次生代谢产物等多种生物活性物质的功能性微生物发酵液体或固体[4]，因其具有抗氧化、美容养颜、减肥瘦身、增强机体免疫力等多种保健功效，加之水果蔬菜气味芬芳，香气宜人，果蔬类酵素在年轻消费人群中备受青睐，并有添加酵素的保健食品和面膜等副产品问世，现阶段酵素产品已实现商业化，在国内外市场的发展空间广阔[5-7]。

研究以猕猴桃和葡萄为原料发酵水果酵素，通过测定酵素自然发酵过程中pH、总酸、总酚、维生素C含量变化来分析发酵过程中活性成分的变化；以DPPH自由基清除率、羟基自由基清除率和还原力为抗氧化性指标，评价猕猴桃葡萄酵素的抗氧化活性，为水果酵素的综合开发利用提供一定理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

葡萄、猕猴桃、白砂糖、柠檬，购于保山市红叶超市；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼/DPPH（上海阿拉丁生化科技有限公司）；氢氧化钠、铁氰化钾、3,5-二硝基水杨酸（广州化学试剂厂）；抗坏血酸、硫酸亚铁、碳酸氢钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、碳酸钠（北京化学试剂公司）；三氯化铁（合肥巴斯夫生物科技有限公司）；2,6-二氯靛酚（上海展云化工有限公司）；邻苯二甲酸氢钾、三氯乙酸、无水乙醇、没食子酸（天津市风船化学试剂科技有限公司）。

1.2 设备与仪器

UV-2600紫外-可见分光光度计（日本岛津公司）；HH-4恒温水浴锅（常州国华电器有限公司）；PHS-3C pH计（上海仪电科学仪器有限公公司）；1DL 5A离心机（上海安亭科学仪器厂）；SW CJ 1D单人双面无菌操作台（苏州净化设备有限公司）。

1.3 试验方法

1.3.1 猕猴桃葡萄酵素的制备

纯净水对新鲜猕猴桃、葡萄及柠檬简单冲洗以除去表面灰尘，在无菌操作台中晾干表皮水分，猕猴桃去皮切片、葡萄保留完整，柠檬切片，白砂糖用紫外灯杀菌30 min后备用。猕猴桃、葡萄与白砂糖按质量比1∶1∶1的比例加入到已消毒的玻璃发酵罐中，按照一层猕猴桃、一层葡萄、一层糖的顺序铺到罐子八分满，底层和最后一层铺上柠檬。在25±2 ℃恒温箱中发酵49 d，pH稳定于3～3.5之间判断发酵结束。

1.3.2 样品液的制备

在整个发酵过程中，每隔7 d取样一次进行相关指标测定。样品的制备：取20 mL酵素原液，按3 500 r/min离心10 min，取上清液得到样品。

1.3.3 理化指标的测定

pH的测定：按参考文献[8]GB/T 10468规定的方法测定；总酸的测定：参照参考文献[9]GB 12456食品中总酸的测定。

1.3.4 功效成分的测定

1.3.4.1 总酚含量的测定

参考李飞等[10]方法，取1 mL酵素样品，用超纯水稀释至10 mL得到待测液，取0.5 mL待测液加入到0.5 mL 50%的福林酚试剂中，充分混匀后静置2 min，再加入1.5 mL 20%的碳酸钠溶液，混匀，常温避光静置1 h后在760 nm处测定其吸光度，平行测定3次。用超纯水做空白对照，以没食子酸等价物来表示。以没食子酸为标准品，绘制标准曲线，得标准曲线线性方程y=0.082 0 x+0.003 5（R2=0.999 3）。

1.3.4.2 维生素C含量的测定

参照参考文献[11]《GB 5009.86食品中抗坏血酸的测定》2,6-二氯靛酚滴定法。

1.3.5 抗氧化活性分析

1.3.5.1 DPPH自由基清除能力[12]

取1 mL酵素样品液，用超纯水稀释至10 mL得待测液。取2 mL待测液，加入2 mL的2×10-4mol/L的DPPH乙醇溶液，用超纯水稀释到20 mL，混匀避光放置30 min，在波长517 nm条件下，测定其吸光度。以0.01 mg/mL的维生素C作对比。DPPH清除率按式（1）计算。

式中：A1为待测液吸光度；A2为乙醇溶液替代DPPH溶液的吸光度；A3为乙醇溶液替代待测液的吸光度。

1.3.5.2 羟基自由基清除率[13]

取1 mL酵素样品，用超纯水稀释至10 mL得到待测液。取2 mL待测液，加入2 mL 6 mmol/L的硫酸亚铁溶液和2 mL 6 mmol/L过氧化氢溶液，用超纯水稀释到20 mL，混匀后静置10 min，再加入2 mL的6 mmol/L的水杨酸溶液，混匀置于37 ℃恒温水浴锅中恒温30 min后，在波长510 nm处测定其吸光度。以0.01 mg/mL的维生素C作对比。羟基自由基清除率按式（2）计算。

式中：A1为样品液吸光度；A2为蒸馏水代替水杨酸的吸光度（对照）；A3为蒸馏水替换待测液的吸光度（空白）。

1.3.5.3 还原力的测定

采用铁氰化钾还原法[14]，取1 mL酵素样品，用超纯水稀释至10 mL得到待测液。取0.5 mL待测液，加入2.5 mL pH 6.6的磷酸缓冲液和质量分数为1%的铁氰化钾溶液2.5 mL，充分混匀后在50 ℃水浴锅中反应30 min，冷却，再加入2.5 mL质量分数为1%的三氯乙酸，充分混匀，加入0.5 mL三氯化铁，用超纯水在试管中稀释到20 mL，静置5 min后在波长700 nm处测定吸光度。

2 结果与分析

2.1 酵素发酵过程中理化指标的测定

2.1.1 酵素发酵过程中pH的变化

pH的动态变化在一定程度上能反映发酵过程是否正常。由图1可知：发酵液pH在7 d内从起始pH 4.71降到3.40，表明酵素前期发酵非常迅速，主要是乳酸菌发酵导致发酵液中有机酸急剧增加所致；7 d后pH在3.4上下小范围波动，这可能是发酵进入稳定期，其次菌体在生长和代谢过程中产生大量CO2，CO2在水溶液中溶解度不稳定，产生的HCO3-可从有机酸结合H+，从而防止氢离子浓度进一步升高，使发酵液具有一定缓冲能力[15]。

图1 酵素发酵过程中pH的变化

2.1.2 酵素发酵过程中总酸含量的变化

酸度是衡量酵素发酵成熟度和发酵液品质的重要理化指标[16]。由图2可知，总酸含量从0.07 g/L上升至0.13 g/L，前三周增长较快，这可能是因为在此期间环境中营养物质丰富，有利于一些产酸微生物大量繁殖，从而产生大量的乳酸、醋酸等次生代谢产物[12]。过后增长有小幅波动后趋于平稳，可能是因为发酵液中糖类物质的消耗，部分微生物开始利用有机酸作为碳源，从而使得总酸含量下降，发酵后期乳酸菌继续进行发酵，将多元酸转变成一元酸，抑制总酸上升的趋势[17]。

图2 发酵过程中总酸含量的变化

2.2 酵素发酵过程中功效成分的测定

2.2.1 酵素发酵过程中总酚含量的变化

酵素发酵过程中总酚含量变化如图3所示。总酚是指样液中所有的酚类物质，是绝大多数具有抗氧化活性物质的总称。通过测定总酚含量，可判断出抗氧化性的变化趋势[18]。酵素在发酵过程中总酚含量总体呈上升趋势，第4周和第5周有小幅下降，发酵后期总酚含量达24.96 mg/mL，相较发酵前提高19.7%。猜测总酚含量的增加原因有二：一是总酚含量增加的原因是微生物把庞杂的酚类物质变换成了简单的酚类物质[19]；二是发酵过程中部分酚类物质的持续溶出，使总酚含量逐步增加[20]。21～35 d出现总酚含量下降，可能是酚类物质被微生物分解成小分子物质，发生降解反应引起的[5]，这可能与微生物对多种构型多酚的转化有关，多酚组分含量的变化会影响酵素的抗氧化酚类物质含量的变化，会相应增强酵素的抗氧化活性[21]。

图3 酵素发酵过程中总酚含量变化

2.2.2 酵素发酵过程中维生素C含量的变化

由图4可知，由于新鲜的猕猴桃和葡萄含有大量维生素C，故发酵第一天维生素C含量高达82.8 mg/100 mL。随着发酵时间延长，维生素C含量一直呈下降趋势，发酵第2周和第3周下降幅度较大，分析原因可能是由于微生物的相关活动和利用，另外，虽然酵素的酸性环境能保护其稳定性，但维生素C作为强还原性物质会有不同程度的流失[22]。发酵至49 d时维生素C含量仅有33.2 mg/100 mL，发酵前后下降61.1%。

图4 发酵过程中维生素C含量的变化

2.3 抗氧化活性测定

2.3.1 酵素发酵过程中DPPH自由基清除能力的变化

DPPH自由基被广泛运用于评价短时间内的抗氧化活性[23]。由图5可知，酵素对DPPH自由基清除率变化趋势为波动中逐渐增大，发酵至49 d时清除率为77.55%，但相较于0.01 mg/mL维生素C对DPPH自由基清除率（92.71%）仍有一定差距。分析原因可能是发酵初期酚类物质少，而维生素C含量较高。维生素C能显著清除自由基，但在发酵过程中维生素C含量不断减少，DPPH自由基清除率出现了短时间的下降，发酵后期总酚含量增加，而维生素C含量不断下降，此时DPPH自由基清除率主要受总酚含量影响。研究表明酚类物质能给出一个氢离子并通过共振杂化而稳定，具有高自由基清除能力[24]，这也基本符合试验DPPH自由基清除率在一定程度上随着总酚含量变化而产生相应波动的规律。

图5 发酵过程中DPPH自由基清除率的变化

2.3.2 酵素发酵过程中羟基自由基清除能力的变化

羟基自由基属活性氧中的一种，在体内可与金属离子发生氧化，使金属离子形成高氧化态，可损害机体细胞，进而引发慢性病以及衰老等疾病[25]。由图6可知，酵素对羟基自由基的清除率总体呈平稳上升的趋势。发酵至49 d时清除率为63.65%，接近0.01 mg/mL维生素C对羟基自由基清除率（65.69%）。发酵中期清除率增幅较大，可能是发酵过程中产生SOD、多酚、皂苷和多糖等具抗氧化活性物质[26]。

图6 酵素发酵过程中羟基自由基清除率的变化

2.3.3 酵素发酵过程中还原力的变化

一种物质还原能力的大小直接反应其抗氧化活性的大小。由图7可知，猕猴桃葡萄酵素的还原力总体呈上升趋势，之后缓慢下降。第35天时达到0.246，发酵第49天时，由最初的0.206上升到0.239，接近0.01 mg/mL维生素C的还原力（0.253），说明随着发酵的进行发酵液中抗氧化成分逐渐增加。

图7 酵素发酵过程中还原力的变化

2.4 总酚含量、与抗氧化能力参数相关性分析

利用SPSS 17软件，对发酵过程中总酚含量与其抗氧化能力参数的相关性进行分析，结果见表1。

表1 总酚含量与抗氧化活性的相关性

从表1可知，总酚含量与DPPH清除率、羟基自由基清除率、还原力的相关系数分别为0.875，0.923和0.804，且一般认为相关系数（r）在0.8～1.0之间是极强相关，r在0.6～0.8之间是强相关，0.4～0.6之间是中等程度相关，r在0.2～0.4之间是弱相关。说明总酚含量与DPPH清除率、羟基自由基清除率、还原力之间存在极强的正相关性（P＜0.01）。

3 结论

文章以猕猴桃和葡萄为原料，通过自然发酵制备酵素，监测发酵过程中各理化指标及体外抗氧化能力的变化，并进行相关性分析。结果表明，发酵过程中pH和维生素C持续降低，总酸、总酚呈波动式上升趋势；抗氧化活性（DPPH自由基清除率、羟自由基清除率和还原力）总体呈现持续增长趋势并于发酵后期达稳定状态，其中羟自由基清除率和还原力与0.01 mg/mL维生素C表现接近，DPPH自由基清除率与对照仍有一定差距。功能成分与抗氧化能力参数相关性表明，总酚含量与DPPH清除率、羟基自由基清除率、还原力之间均存在极显著正相关性（P＜0.01）。综上所述，发酵能促进体系中物质转换和活性物质生成，从而提升酵素的品质，研究结果可为猕猴桃葡萄酵素的发酵机理以及产品的综合开发利用提供一定的理论参考。