不同卤水添加量对豆腐凝胶特性的影响

力雯慧，张志衡，杨雅婧，李玉娥，陈振家*

山西农业大学食品科学与工程学院（晋中 030801）

大豆起源于中国，距今已有数千年的历史，具有较高的营养价值，主要成分有蛋白质（40%）、碳水化合物（35%）和油脂（20%）。豆腐是中国传统的豆制品，其营养丰富、热量较低，深受大众喜爱。豆腐主要是大豆经过浸泡、磨浆、煮浆、点浆、蹲脑和压制成型等工艺制成的[1]，其中点浆是最关键的一步。凝固剂的选择对豆腐的感官性质有着重要影响。刘宁等[2]将凝固剂分为7种，即盐类凝固剂、酸类凝固剂、酶类凝固剂、豆清发酵液、复合凝固剂、多糖类凝固剂和生物凝固剂。试验用到的是盐类凝固剂，市场上常见的盐类凝固剂主要分为镁盐和钙盐2种，常用的有卤水（主要成分为MgCl2）和石膏（主要成分为Ca2SO4），使用盐凝固剂做出来的豆腐风味鲜美，出品率高但存放期短。

卤水豆腐是我国最常见的豆腐，使用的凝固剂一般称之为卤水，其主要成分为氯化镁。卤水豆腐具有较大的弹性及较强的硬度和韧性，质地不如内酯豆腐质地软嫩，水分相对较低，在80%左右，但弹性较好，而正是由于水分少，故而卤豆腐特有的风味更加浓，质地更硬且更适宜烹饪。但现阶段对于卤水豆腐品质特性的研究不够深入，关于卤水豆腐凝固机理存在很大争议，这些问题需要进一步探究。试验主要研究卤水豆腐凝胶特性和凝固过程随卤水（MgCl2）添加量的变化规律，为卤水豆腐的凝固机理提供数据参考。

1 材料与仪器

1.1 原料与试剂

大豆（绥化市正大米业有限公司）；考马斯亮蓝G-250、β-巯基乙醇、牛血清蛋白、SDS、溴酚蓝、过硫酸铵、低分子量蛋白标样、三羟甲基氨基甲烷、四甲基乙二胺（北京索莱宝科技有限公司，分析纯）；甲叉双丙烯酰胺、无水乙醇、甘氨酸、甘油（生工生物工程股份有限公司，分析纯）；氯化钠、尿素、罗丹明（国药集团化学试剂有限公司，分析纯）；氢氧化钠（天津市凯通化学试剂有限公司，分析纯）；硫酸（成都市科隆化学品有限公司，分析纯）；氯化镁（安琪酵母股份有限公司，食品级）；硫酸钾（天津市科密欧化学试剂开发中心，分析纯）；硫酸铜（天津市北辰方正试剂厂，分析纯）。

1.2 主要设备与仪器

FSM-120-4P型分离式磨浆机（沈阳市食品机械制造有限公司）；XS-C型成型机（天思食品机械有限公司）；TMS-Pro质构仪（Food Technology Corporation）；DYY-7C型电泳仪（北京市六一仪器厂）；UV-1200型可见分光光度计（上海菁华科技有限仪器公司）；HH型数显恒温水浴锅、79-1型磁力加热搅拌器（金坛市科析仪器有限公司）；HC-2064型高速离心机、KDC-1044L型大容量低速离心机（安徽中科中佳科学仪器有限公司）；DY89-Ⅱ型电动玻璃均质机（宁波新芝生物科技股份有限公司）；Tensor 27型傅里叶变换红外光谱仪（Bruker德国布鲁克）；SCIENTZ-18N型冷冻干燥机（宁波新芝生物科技股份有限公司）；TCS SP8型激光扫描共聚焦显微镜（Leia）。

1.3 试验方法

1.3.1 豆乳的制备

参考Guo等[3]的方法并做一定修改。将大豆用清水清洗3次，在室温下浸泡12 h，待水分沥干后，将大豆与水以1∶5（g/mL）比例混合磨浆，粗浆经0.075 mm孔径（200目）过筛去除豆渣后，加热煮沸5 min，保温备用。

1.3.2 卤水豆腐的制备

将黄豆清洗3次，去除杂质和灰尘，在室温下浸泡约12 h。待水分沥干后，将黄豆与水以1∶5（g/mL）比例混合，利用分离式磨浆机磨浆，加热煮沸5 min。配制15%卤水（MgCl2溶液）作为凝固剂，在豆浆温度下降到85 ℃时，加入卤水进行凝固，卤水添加量分别为2.0%，3.5%和5.0%（V/V），85 ℃下保温10 min，使用成型机压制成型。

1.3.3 卤水豆腐质构性的测定

将制备好的卤水豆腐切成4 cm×4 cm×1 cm立方体，采用质地多面剖析法（TPA）测定豆腐质构特性[4]。测试参数：测试速度60 mm/s，测试后速度200 mm/s，探头回升高度15 mm，挤压距离5 mm，测试间隔3 s，起始力0.4 N；每个样品需重复测定10次。

1.3.4 卤水豆腐得率、含水量及保水性的测定

按照Kang等[5]的方法测定豆腐得率，将制作好的豆腐于室温下静置5 min后称重，计算100 g干大豆所得豆腐的质量，即为豆腐得率，按式（1）计算。

式中：W1为豆腐质量，g；W2为干大豆质量，g。

参照GB 5009.3—2016《食品安全国家标准食品中水分的测定》中的直接干燥[6]测定豆腐的含水量（MC）。

根据王睿粲[7]的方法测定豆腐保水性。选用带有内管的50 mL离心管，内管底部为网状，放入滤纸片后，称取滤纸片和内管的质量m1，将约1 g豆腐放在滤纸上，称内管和豆腐的总质量m2，以4 000 r/min离心10 min后，再次称内管和豆腐的质量m3，豆腐的保水性按照式（2）测得。

1.3.5 卤水豆腐中蛋白质含量的测定

蛋白质含量的测定参考GB 5009.5—2016《食品安全国家标准食品中蛋白质的测定》[8]。

1.3.6 卤水豆腐凝胶作用力的测定

参考Gómez-Guillén等[9]方法。用小刀切取3 g豆腐凝胶放入研磨器内，分别与20 mL的0.05 mol/L NaCl（SA）、0.6 mol/L NaCl（SB）、0.6 mol/L NaCl+1.5 mol/L尿素（SC）、0.6 mol/L NaCl+8 mol/L尿素（SD）和0.6 mol/L NaCl+8 mol/L尿素+0.2 mol/L β-ME（SE）破碎均质，定容后以10 000×g离心10 min。利用考马斯亮蓝法测定上清液中蛋白质含量。溶解于SB溶液与SA溶液中蛋白质含量之差表示离子键的贡献，溶解于SD溶液与SC溶液中蛋白质含量之差表示疏水性相互作用的贡献，溶解于SC溶液与SB溶液中蛋白质含量之差表示氢键的贡献，溶解于SE溶液与SD溶液中蛋白质含量之差表示二硫键的贡献。

1.3.7 SDS-PAGE

样品的制备：准确称取5 mg卤水豆腐加入样品处理液中，加蒸馏水使总体积为1 mL，振荡均匀冷藏后可进行使用。若样品为液体，则需根据蛋白浓度确定，使最终溶液中蛋白浓度为1 mg/mL。

SDS-PAGE电泳采用Lars等[10]的方法，制得的分离胶浓度12%，浓缩胶浓度5%，上样量6 μL，恒压电泳，电流40 mA，浓缩胶电压100 V，分离胶电压150 V。电泳完毕，固定2 h，染色3 h，脱色2 h，结束后拍照成像，并分析图谱。

1.3.8 傅里叶变换红外光谱分析

参照Shin等[11]的方法。将制备好的生豆浆、熟豆浆及豆腐在真空冷冻干燥作用下冻干成粉状。将冻干样品和KBr以1∶100（W/W）比例在研钵内研磨均匀，使用压片机将混合物压成明片状（压力10 MPa、时间1 min），准备完成后即可进行测定。所选用的波长范围为400～4 000 cm-1，分辨率4 cm-1，扫描次数24次。利用Peakfit软件对测定图谱进行基线校正、去卷积和高斯拟合处理，根据峰与二级结构的对应关系，利用各子峰面积计算二级结构的相对含量。

1.3.9 凝胶微观结构分析

依据上述的方法制备豆乳，微观结构的测定参考Kuipers等[12]方法并稍作改动。取100 mL豆乳加入1 mL 0.2%罗丹明溶液，搅拌均匀，分别配制卤水添加量0，2.0%，3.5%和5.0%的混合溶液，迅速振荡均匀取10 μL滴在载玻片上，盖上盖玻片，周围滴加少量指甲油防止水分蒸发，用锡纸包裹，在90 ℃保温箱中保温1 h，冷却至室温，测试前样品置于阴暗处。使用TCS SP8型激光共聚焦显微镜对凝胶的内部结构进行观察，样品的激发波长是543 nm，检测范围580～700 nm。

1.3.10 数据分析

利用Origin 8.0和Excel软件统计分析数据并作图，用SPSS软件分析不同处理间差异性，显著水平为P＜0.05。

2 结果与分析

2.1 卤水添加量对豆腐质构性的影响

豆腐的质构特性是评价其品质的重要方式之一。选择硬度、弹性、内聚性和咀嚼性4个参数进行分析。有研究指出[13]，豆腐的质构特性是蛋白质三维网络结构特性的外在表征，三维网络结构构建的强弱取决于参与蛋白数量和凝胶形成方式。

由表1可知，随着卤水添加量的增加，豆腐的硬度和咀嚼性显著增加，内聚性先降低后升高，弹性先升高后降低，表明卤水添加量改变了豆腐的质构特性，随着镁离子含量增加，蛋白质聚集程度增加，网络结构的形成更为完善，凝胶硬度增加。这可能是导致豆腐质构特性发生变化的原因。

表1 卤水添加量对豆腐质构性的影响

2.2 卤水豆腐得率、含水量及保水性的测定

豆腐水分状态一般用含水量、得率和保水性表示。豆腐含水量是指制得的鲜豆腐中的水分比例；豆腐得率是指一定质量的干大豆能够制得的豆腐质量，它主要反映豆浆中的蛋白向豆腐凝胶转化过程中转化率的高低[14]；凝胶保水性是指蛋白质凝胶保留水分的能力，它不仅决定凝胶网络结构的细腻程度，还与相关食品的品质有关[15]。

由图1可知，2.0%卤水添加量制备的豆腐含水量、保水性和得率均达到最高，分别为77.96%，46.85%和166.74%，并随着卤水添加量的增加均逐渐降低，可以看出较低的卤水添加量有利于制备含水量高的嫩豆腐。

图1 卤水添加量对豆腐含水量、保水性及得率的影响

2.3 卤水豆腐中蛋白质含量的测定

由图2可知，在卤水豆腐制备过程中，随着卤水添加量的增加，豆腐的总蛋白含量逐渐增加，豆腐中可溶性蛋白含量很少（约0.2%），且随卤水添加量的增加未发生明显变化，说明卤水豆腐中的蛋白质基本都参与豆腐凝胶结构的形成，只有极少量的可溶性蛋白包裹在凝胶结构内部。

图2 卤水添加量对豆腐中蛋白含量和可溶蛋白含量的影响

由图3可知，通过对卤水豆腐中蛋白质亚基组成的测定，结果发现随着卤水添加量的增加，豆腐中亚基条带逐渐加深，可溶性蛋白中几乎没有出现亚基条带，不溶性蛋白的亚基组成与豆腐中的亚基组成基本一致，进一步证明卤水豆腐中的蛋白质主要为不可溶蛋白；加入还原剂后，一些大分子聚集体分解，亚基条带增多，说明二硫键参与卤水豆腐蛋白质凝胶的形成。

图3 卤水添加量对豆腐中蛋白质亚基组成的影响

2.4 卤水豆腐凝胶作用力

豆腐在形成凝胶的过程中，通过分子间作用力的变化，其网络结构不同。形成蛋白网络结构主要是通过疏水作用、氢键、离子键等非共价键和二硫键等共价键，在这些作用力的影响下，凝胶达到平衡状态[16]；向豆腐中加入不同含量的卤水，豆腐凝胶中的作用力也会发生变化。

由图4可知：卤水豆腐中的分子间作用力包含疏水作用、二硫键、离子键和氢键，其中疏水作用占比最高，也最为重要，卤水豆腐中作用力贡献大小排序为疏水作用＞氢键＞二硫键＞离子键。随着卤水添加量的增加，疏水作用增加，二硫键大幅下降，氢键和离子键先增加后减少。由于作用力的结果是根据豆腐凝胶在不同溶液中的溶解度差异计算的，因此不能反映不同豆腐中作用力含量的绝对值，只能反映各作用力在豆腐中所占比例。总的来说，改变卤水添加量后豆腐中作用力组成变化明显，结合豆腐中蛋白含量的测定结果可知，增加卤水添加量后，豆浆中的部分蛋白通过疏水作用结合到凝胶网络中，从而改变了豆腐中作用力的比例。

图4 卤水添加量对豆腐中作用力组成的影响

2.5 SDS-PAGE电泳

由图5（A）可知：卤水豆腐在SA、SB、SC、SD这4种溶液中的亚基条带逐渐增加，说明离子键、氢键和疏水作用参与卤水豆腐的形成，在SA、SB、SC溶液中蛋白主要是以分子量较小的11S亚基形式存在；而SD溶液中亚基组成大幅增加且7S亚基占据主导地位，说明卤水豆腐中7S亚基间的连接主要依靠的是疏水作用，离子键和氢键在豆腐形成中的贡献较低且主要作用于11S的A、B亚基；对比图5（A和B）可知，加入还原剂后，豆腐的蛋白亚基组成发生变化，主要表现在A3亚基的出现、B亚基颜色的加深以及大聚集体（分子量大于100 kDa）的消失，这些亚基主要是在二硫键的作用下参与卤水豆腐的形成。随着卤水添加量的增加，亚基条带颜色加深，表明增加卤水添加量，分子间作用力增强，更多的蛋白亚基参与到豆腐的形成。

图5 不同作用力下卤水豆腐蛋白亚基组成

电泳的结果与卤水豆腐分子间作用力的测定结果符合，疏水作用和二硫键是卤水豆腐中的主要作用力，疏水作用主要参与7S蛋白的形成，11S蛋白的形成主要与离子键、氢键和二硫键有关。

2.6 卤水豆腐红外测定

豆腐在形成过程中，其二级结构发生明显的变化，凝胶网络结构与蛋白质二级结构具有密切的关联性[17-18]。红外光谱图上不同波峰对应不同的基团，如3 250～3 400 cm-1归属于羟基基团，脂肪族氨基酸残基分别在2 800～3 000 cm-1和1 440～1 465 cm-1附近归属于C—H拉伸和弯曲模式，酰胺Ⅰ带是研究二级结构最有用的带，被指定为C＝O拉伸振动，由1 600～1 700 cm-1范围内的波段组成，1 600～1 640，1 640～1 650，1 650～1 660和1 660～1 700 cm-1分别属于β折叠、无规则卷曲、α螺旋、β转角结构[19]。通过对不同豆腐中蛋白质二级结构的测定，能够反映出凝固剂添加量对豆腐中蛋白质聚集状态的影响。

由图6可知，随着卤水添加量的增加，3 250～3 400 cm-1处羟基基团吸收峰强度降低，氢键作用减弱。由表2可知，生豆浆中蛋白质结构主要是以β折叠（32.47%）和β转角（34.33%）为主，α螺旋和无规则卷曲含量相近，分别为16.66%和16.54%。与生豆浆相比，熟豆浆中除β折叠含量增加外，其他3种结构都有不同程度的减少，这主要是由于加热使得豆浆中蛋白质变性，空间结构展开，在氢键、疏水作用等化学键的作用下，蛋白质发生聚集的趋势增大，即大豆蛋白的热聚集行为[20]。与豆浆相比，卤水豆腐中β折叠和β转角含量大幅降低，α螺旋含量大幅增加，无规则卷曲含量小幅增加。卤水添加量对豆腐中蛋白质二级结构的影响显著，β折叠的含量随着卤水添加量的增加而增加，从12.27%增加到13.61%。β转角含量先降低后升高，从14.23%下降到13.2%，后升高至13.99%。α螺旋含量显著降低，从53.1%下降至44.82%。无规则卷曲含量显著增加，从20.41%上升到27.59%。卤水豆腐蛋白质二级结构的有序性整体提高，不同卤水添加量下豆腐中二级结构的差异性是其表现出不同凝胶特性的重要原因。

图6 不同卤水添加量制备的豆腐中蛋白质红外光谱分析

表2 卤水豆腐中蛋白质二级结构百分比图 单位：%

2.7 不同卤水添加量下豆乳凝胶的微观结构变化分析

利用激光共聚焦显微镜扫描技术可以更直观地观察豆乳凝胶的絮凝状态。图7中的簇状堆积部分是蛋白质聚集体经过罗丹明标记后形成的区域，而图中的空隙部分代表水分的分布区域。结果表明，不添加卤水时，熟豆乳体系中的蛋白质粒子分布均匀、致密紧实，说明蛋白质没有发生大量聚集，而添加2%的卤水后，豆乳体系中的蛋白质分开始聚集，逐渐形成凝胶网络结构，但此时的凝胶结构较为连续，凝胶链状结构形成不充分，且蛋白聚集体间的空隙较小。随着卤水添加量的增加，豆乳体系中蛋白质的聚集程度进一步增加，聚集体间的孔隙明显变大且分布均匀，表明卤水添加量的增加极大地增大了蛋白质的聚集程度，凝胶结构变得更加有序，网络结构形成更为充分。

图7 不同卤水添加量形成凝胶的的CLSM图

3 结论

通过比较不同卤水添加量制备的卤水豆腐的凝胶特性发现，随着卤水添加量的增加，豆腐的硬度和咀嚼性增加，质构特性发生显著性变化。豆腐的含水量、保水性和得率随着卤水添加量的增加而逐渐降低，且可溶性蛋白含量逐渐降低，疏水作用增加，二硫键占比明显下降，疏水作用主要参与7S蛋白的形成，离子键、氢键和二硫键主要作用于11S蛋白。在加热的作用下，豆浆中的β折叠含量增加，蛋白质发生大的聚集，而随着卤水添加量的增加，β折叠和无规则卷曲含量增加，β转角含量先降低后升高，α螺旋含量明显下降，卤水添加量对豆腐中二级结构产生显著影响。