抗番茄溃疡病菌菱角壳活性物质提取条件优化及抑菌活性研究

闫然，秦雪梅，王琪，蔡瑾*

1.山西大学中医药现代研究中心（太原 030006）；2.山西大学化学生物学与分子工程教育部重点实验室（太原 030006）；3.山西大学应用化学研究所（太原 030006）；4.山西大学生命科学学院（太原 030006）

植物源杀菌剂是一类绿色健康杀菌剂，能够杀死或抑制病原菌，具有对环境友好等优点[4]。许多可食用植物的非食用部位能提取出具有抑菌活性的物质。菱角（Trapa bispinosaRoxb），又名菱实、沙角，在我国作为食物被广泛种植[5]。菱角壳是菱角果实的外皮，一般在菱角果实加工时被丢弃，没有得到有效的开发和利用，造成资源浪费和环境污染[6]。有研究表明在菱角壳中存在抑菌活性物质[7]。因此，试验以菱角壳为材料，以Cmm为供试菌，对菱角壳活性物质的提取条件进行正交试验优化，以期提高菱角壳抑制Cmm活性物质的产量；分析菱角壳活性物质处理后Cmm的AKP活性、细胞膜通透性及细胞膜电位的变化。试验结果可为Cmm绿色有效防治及番茄的食用安全提供新途径。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

供试菱角，购自浙江嘉兴南湖，洗净后剥壳、晾干，粉碎备用。

番茄溃疡病菌（Clavibacter michiganensis subsp.michiganensis，Cmm）由中国普通微生物菌种保藏管理中心提供，试验完成后所有病菌及试验用具均已做除害处理。

罗丹明123（Sigma公司）；无水乙醇、二甲基亚砜（天津市大茂化学制剂厂）；PI染色试剂盒（上海生工生物有限公司）；AKP测试盒（南京建成生物工程研究所）。

1.2 仪器与设备

Synergy HTX多功能酶标仪（美国Bio Tek仪器有限公司）；F-280型荧光分光光度计（天津港东科技发展股份有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 菱角壳活性物质提取流程

质疑与建构：著作权法创作激励目的之二重奏............................................................................................司 明 02.77

菱角壳粉碎后过0.300 mm孔径（50目）筛，用无水乙醇作为溶剂，以一定的温度、时间和料液比回流提取。提取液在2 500 r/min下离心15 min，所得上清液旋蒸去除溶剂后得到粉末状固体，即为菱角壳抗Cmm活性物质。

1.3.2 菱角壳抑菌活性物质的检测

将1.3.1所得活性物质用40% DMSO配制至20 mg/mL。DMSO（40%）作为阴性对照。通过在琼脂平板上打孔来测定抑菌活性。在琼脂平板培养基上加入200 μL Cmm的细菌悬浮液（106CFU/mL）并涂布均匀。用10 mm打孔器在上述培养基上均匀打孔，并将200 μL各提取条件下得到的活性物质加入到对应孔中，培养箱（28 ℃，1 d）培养后，测量抑菌圈的直径。

1.3.3 菱角壳抑菌活性物质提取工艺优化

1.3.3.1 单因素试验

参照1.3.1提取菱角壳活性物质，并用1.3.2的方法检测活性物质的抑菌效果。以抑菌圈直径为指标检测并分析菱角壳活性物质受提取温度（20，40，60，80和100 ℃）、提取时间（3，6，9，12和15 h）、料液比（1∶5，1∶10，1∶15，1∶20和1∶25 g/mL）影响下抑菌能力的变化。

1.3.3.2 正交试验

在单因素试验的基础上进行正交试验，设置温度（A）、时间（B）、料液比（C）3种因素，每个因素设3个水平。试验选用L27(313)正交设计表（表1），正交试验的27份菱角壳活性物质标记顺序号1～27。将所得27组菱角壳活性物质按照1.3.2的方法测抑菌活性。根据结果进行方差分析，以获得最佳的提取条件。后续试验所用的菱角壳活性物质均在最佳提取条件下获得。

表1 正交试验因素和水平

1.3.4 测定菱角壳活性物质最小抑菌浓度（MIC）

菱角壳活性物质的MIC采用96孔板微量稀释法测定。菱角壳活性物质用7% DMSO助溶后加入到液体培养基中，采用二倍稀释法，使其最终浓度达到40～0.01 mg/mL。另配7% DMSO的样品作为阴性对照。将200 μL上述液体培养基和10 μL菌液（106CFU/mL）依次加入于96孔板的对应孔中，于28 ℃培养1 d。肉眼观察培养基浑浊度。

1.3.5 对细胞壁的影响试验

取100 mL液体培养基，在其中加入100 μL Cmm（106CFU/mL）及定量用0.2% DMSO助溶的菱角壳活性物质，调终浓度至1/2 MIC，MIC和2 MIC。以不加入菱角壳活性物质的样品作为阴性对照，摇床培养（28 ℃，120 r/min，24 h）。在4 000 r/min下离心10 min取上清液。AKP测定试剂盒用于检测上清液中AKP活性，即为细胞外AKP活性。

1.3.6 细胞膜通透性的测定

取100 mL液体培养基，在其中加入100 μL Cmm（106CFU/mL）及定量用0.2% DMSO助溶的菱角壳活性物质，调终浓度至1/2 MIC，MIC和2 MIC，以仅加入0.2% DMSO无菱角壳活性物质的样品作为阴性对照，摇床培养（28 ℃，120 r/min，24 h）。将样品以4 000 r/min的速度离心10 min，除去上清液，用生理盐水冲洗3次，重新悬浮，调A600nm=0.6。取95 μL菌液与5 μL PI染剂充分混合均匀，黑暗下室温孵育30 min，生理盐水冲洗3次，再次重悬，在λex=488 nm和λem=630 nm条件下测定荧光强度。

1.3.7 细胞膜电位变化的测定

按1.3.6方法制备A600nm=0.6重悬液。在1.5 mL重悬液中加入5 μL的罗丹明123。避光培养30 min后，生理盐水洗涤3次，重悬后测定荧光强度（λex=505 nm和λem=530 nm）。

1.4 数据处理

所有试验均平行重复3次，使用SPSS软件对数据进行统计分析，差异显著性采用Duncan新复极差法检测，数值=平均值±标准差（n=3）。采用Origin 8.5软件进行数据处理和绘图。

2 结果与分析

2.1 菱角壳活性物质提取工艺优化

2.1.1 单因素试验分析

菱角壳活性物质抑菌效果受提取温度、提取时间、料液比3个因素的影响，结果在图1中显示。图1（A）显示，菱角壳活性物质的抑菌效果在20～60 ℃的提取温度下，随着提取温度的升高而增强，达到60℃时抑菌效果最佳（P＜0.05），此后随着温度的升高，抑菌效果开始减弱。因此，选择40，60和80 ℃进行后续正交试验。图1（B）说明，提取时间的延长会使菱角壳活性物质的抑菌效果呈现先增强后减弱的趋势。提取时间为6 h时抑菌效果最佳（P＜0.05），因此选择3，6和9 h进行后续正交试验。图1（C）表明，料液比1∶5 g/mL时，抑菌活性较弱，料液比变化至1∶10 g/mL时，抑菌效果最强，此后液体占比进一步增大，抑菌作用逐步减弱。因此，选择1∶5，1∶10和1∶15 g/mL进行后续正交试验。

图1 提取温度、提取时间、料液比对菱角壳活性物质抑菌效果的影响

2.1.2 正交试验分析

为考察不同因素间的相互作用对菱角壳活性物质抑菌效果的影响，并分析最佳提取条件，用L27(313)正交设计表进行提取温度、提取时间、料液比3个因素的正交试验。表2显示正交试验的结果，菱角壳的活性物质对Cmm的抑制作用因提取条件不同而有显著差异。根据极差值R大小，温度（A）、时间（B）和料液比（C）影响菱角壳活性物质抑菌效果的先后顺序可排列为B＞A＞C。就不同因素相互作用的影响而言，由温度和时间交互作用（AB）、温度和料液比交互作用（AC）、时间和料液比交互作用（BC）产生的极差R分别为是2.71，1.83和2.69，因此，交互作用的影响大小顺序依次可排列为AB＞BC＞AC。综合考察因素以及因素间交互作用的极差值R大小，影响菱角壳活性物质抑菌效应的因素顺序依次可排列为AB＞BC＞B＞A＞AC＞C。

表2 L27(313)正交试验设计及结果

接表2

用方差分析法分析正交试验结果，考察菱角壳活性物质的抑菌效果受各因素及各因素间交互作用的影响，结果见表3。菱角壳活性物质对Cmm的抑制作用，在所考察的3种提取条件中，受提取温度（F=11.39＞F0.01（2,8）=8.65）和时间（F=15.80＞F0.01（2,8）=8.65）的影响是非常显著的；提取料液比没有显著（F=0.84＜F0.05（2,8）=4.46）影响菱角壳活性物质对Cmm的抑制效果。同时，提取时间与提取温度及提取时间与料液比之间有显著（F=4.35＞F0.05（4,8）=3.84；F=4.29＞F0.05（4,8）=3.84）交互作用，但提取温度和料液比间不存在交互作用（F=0.13＜F0.05（4,8）=3.84）。

表3 正交试验的方差分析结果

根据正交试验结果，理论最优水平为A2B3C3。考虑到经济效益及菱角壳活性物质抑菌效果，抑菌效果最佳的提取条件应为A2B3C1，即提取温度60 ℃、提取时间9 h、料液比1∶5 g/mL，此时菱角壳活性物质的抑制效果最佳。

2.2 最低抑菌浓度（MIC）测定结果及分析

菱角壳活性物质对Cmm的MIC测定结果如表4所示。40～0.313 mg/mL处理浓度的菱角壳活性物质较阴性对照而言，培养基澄清，无Cmm生长。随着菱角壳活性物质浓度的降低，培养基逐渐变得浑浊，菌量增多。由此可知，菱角壳的抑菌活性物质对Cmm的MIC为0.313 mg/mL。

表4 不同浓度的菱角壳活性物质对番茄溃疡病菌的抑制效果

2.3 对病原菌细胞壁的影响

细胞壁不仅能保持细胞形态，还可以防止抑菌剂等外来物质进入细胞[8]。AKP酶在细胞壁完整性正常的情况下存在于细胞壁和细胞膜之间，很难在细胞外检测到其存在[9]。因此，细胞外AKP酶的水平可作为判断细菌细胞壁完整性的依据。图2显示，用菱角壳活性物质处理后Cmm胞外AKP活力较对照组显著（P＜0.05）增加，可知1/2 MIC，MIC和2 MIC的菱角壳活性物质均可以破坏菌体细胞壁的完整性，导致AKP外漏。

图2 番茄溃疡病菌胞外AKP活力受菱角壳活性物质的影响

2.4 细胞膜通透性分析

细胞膜参与生物体内许多生理代谢过程，其稳定的结构是维持细胞生理功能正常进行的前提[10]。PI荧光染料是核DNA的染色试剂，能够通过损伤的细胞膜进入细胞内进而对核进行染色，因此其可用于检测细胞膜通透性[11]。由图3可知，Cmm经菱角壳活性物质处理后荧光强度随着菱角壳活性物质浓度的升高而显著（P＜0.05）增强。结果表明，菱角壳活性物质可破坏细胞膜的通透性，影响菌体正常生理状态，从而表现出良好的抑菌效果。

图3 番茄溃疡病菌细胞膜通透性受菱角壳活性物质的影响

2.5 细胞膜电位变化分析

罗丹明123加入到菌体中后，检测其荧光强度变化可以反映出菌体细胞膜电位变化[12]。图4表明，菱角壳活性物质作用后，Cmm的荧光强度显著（P＜0.05）低于阴性对照组。由此可知，菱角壳活性物质破坏菌体细胞膜，导致罗丹明123释放，膜电位降低，发生去极化，从而影响Cmm的正常生理活动。

图4 番茄溃疡病菌细胞膜电位受菱角壳活性物质的影响

3 结论

试验从番茄食用安全的角度出发，选用菱角壳为材料，Cmm为指示菌，对其抗Cmm活性物质提取条件进行优化，最终确定以提取温度60 ℃、提取时间9 h、料液比1∶5 g/mL作为提取条件。AKP活力数据显示，菱角壳活性物质能破坏细胞壁。罗丹明123染色和PI染色试验数据显示，活性物质能够降低细胞膜电位，损坏细胞膜通透性。试验结果可得到菱角壳高效抗Cmm的活性物质，同时明确其抑菌作用特性，为绿色防治Cmm及防范番茄食用安全隐患提供可能对策。