复方蓝莓越橘颗粒制备及安全性评价

刘磊

1.神威药业集团有限公司（石家庄 051430）；2.京津冀联创药物研究（北京）有限公司（北京 100025）

视疲劳的产生是眼或全身器质性因素与精神心理因素相互交织形成的结果[1-2]，通常以患者自觉眼部症状为突出表现，因此，在临床上又常称为眼疲劳综合症。近年来，随着视屏终端设备和3D立体影像的普及和现代社会工作生活节奏的加快，视疲劳人群的范围也在不断扩大[3-4]。视疲劳成为影响人们生活、工作及身体健康的一大因素。具有缓解视疲劳功能的保健食品正逐渐成为市场焦点[5]，因此具有缓解视疲劳功能的保健食品投放市场，将为众多视疲劳者带来改善身体状况的健康食品。

研究表明，蓝莓提取物花青素对视物模糊、眼干涩、明视持久度及总有效率有明显改善，可以起到缓解视疲劳的作用[6-7]。叶黄素存在于人体眼部所有组织中，但人体不能合成，只能通过摄入补充。研究表明叶黄素有助于视觉系统的发育，可提高视觉表现和低照明条件下的空间辨别度，对非增殖性糖尿病视网膜病变患者的视力有改善作用[8-11]。叶黄素和越橘提取物均具有缓解视疲劳的保健功效，二者复合使用具有协同增效的作用[12-13]。张莉华等[14]研究发现叶黄素、欧洲越橘提取物、蓝莓粉等制成的咀嚼片，可明显减轻视疲劳症状。葡萄籽提取物富含原花青素，有研究指出葡萄籽提取物中原花青素可能因其抗氧化性有助于预防与氧化应激相关的白内障[15]。木糖醇是食品中常用的甜味剂，其甜度与蔗糖相当，具有清凉感。因其具有防龋齿、不升糖等功效而被广泛应用于饮料、糖果、无糖食品等各领域[16]。因此试验选用木糖醇作为甜味剂。

蓝莓粉、越橘浓缩粉、叶黄素、维生素A醋酸酯、维生素B6、葡萄糖酸锌、亚硒酸钠、木糖醇、葡萄籽提取物均具有缓解疲劳的功效，因此通过这几种原料的复配，旨在开发一款具有缓解视疲劳功效的保健食品。通过查阅中医药理论及科学文献，试验原料无配伍禁忌，单个原料及用量具有安全性，但配伍后安全性尚没有理论依据，因此进一步对复方蓝莓越橘颗粒进行毒理安全性评价试验，为其食用提供安全性依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

蓝莓粉、越橘浓缩粉、叶黄素、葡萄籽提取物、维矿预混料（维生素A醋酸酯5 000 μg/g、维生素B675 mg/g、葡萄糖酸锌100 mg/g、亚硒酸钠500 μg/g、麦芽糊精）、麦芽糊精、木糖醇（均为SW公司）。

由西安交通大学医学院实验动物中心提供的SD大鼠（质量合格证号：61001700001708，61001700001904）、昆明种小鼠（质量合格证号：61001700001747，61001700001743），均为SPF级。动物饲料、垫料（西安交通大学医学院实验动物中心）。试验动物房为屏障系统，使用许可证号SYXK（陕）2012-006，温度20～25 ℃，相对湿度45%～65%。

生化试剂盒（深圳迈瑞生物有限公司）；血细胞测定试剂；叠氮化钠；1,8-二羟基蒽醌；2-氨基芴（Sigma Aldrich公司）；环磷酰胺、敌克松（江苏盛迪医药有限公司）；大鼠肝微粒体酶（S9）；小牛血清；甲醇；磷酸盐缓冲液（赛普锐思科技有限公司）；蒸馏水自制，合格备用。

1.2 仪器与设备

电子分析天平（AL204型，梅特勒-托利多仪器有限公司）；电热鼓风干燥箱（101型，北京市永光明医疗仪器有限公司）；全自动生化分析仪（BS42型，深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司）；血细胞分析仪（BC-2800vet型，深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司）；电子天平（AP135W型，岛津中国有限公司）；生物显微镜（RH3201型，南派大工科技有限公司）；离心机（TGL-16型，常州亿通分析仪器制造有限公司）；恒温水浴锅（HH-8型，常州亿通分析仪器制造有限公司）；恒温培养箱（SHPY-70F型，深圳市澳德玛电子科技有限公司）；超净工作台（SW-CJ-2FD型，苏州净化设备有限公司）；计时器；载玻片；试管；培养皿；解剖器械。

1.3 试验方法

1.3.1 复方颗粒制备

1.3.1.1 工艺流程

原料过筛→称量、混合→制软材→制粒→干燥→整粒→包装

1.3.1.2 配方优化

试验在前期大量试验研究工作基础上，确定叶黄素和维矿预混料添加量分别为2%和1%。蓝莓粉、越橘浓缩粉、葡萄籽提取物均含有原花青素等功效性成分，木糖醇有明显清凉感，4种原料对终产品的口感风味影响较大，因此将原料按不同比例混合拼配，采用L9(34)进行正交试验设计，以感官评分为评价指标，通过正交优化试验对其用量进行筛选，确定终产品配方。因素水平设定如表1所示。

表1 正交因素水平表 单位：%

1.3.1.3 感官评价

取5 g成品，用100 mL温水溶解，组织30名专业人员对产品进行感官评价，以溶液状态、香味、风味口感作为考察指标进行打分，取平均值。评分标准如表2所示。

表2 产品感官评定标准

1.3.2 急性毒理试验

选用SD大鼠20只，体重180～220 g，雌、雄各半。按最大耐受剂量法，设18.0 g/（kg·bw）为灌胃剂量（相当于人体推荐量的216倍）。将适量样品粉碎，称取180.0 g加蒸馏水至200 mL混悬，动物禁食16 h，不禁水，按20 mL/（kg·bw）经口灌胃1次，灌胃后连续观察14 d内动物的一般健康状况及死亡情况，试验开始、第7和第14天称量大鼠体重，试验结束后处死动物大体解剖，根据最大耐受量判断受试物的急性毒性。

1.3.3 Ames试验

以多氯联苯诱导的大鼠肝微粒体酶（S9）作为体外代谢活化系统，用间接致突变物（10 μg/皿的2-氨基芴用于TA97、TA98、TA100，50 μg/皿1,8-二羟基蒽醌用于TA102菌）测定S9活性。试验采用TA97、TA98、TA100、TA102这4种菌株，样品设5 000，1 000，200，40和8 μg/皿5个剂量组及溶剂对照组（蒸馏水）、自发回变组和阳性对照组。取适量样品粉碎，准确称取1.00 g，加蒸馏水至20 mL，混合均匀即为最高工作浓度5%的混悬液，试验时取100 μL该工作液加入平皿即为样品最高浓度（5 000 μg/皿），以最高浓度为基础用蒸馏水逐步5倍稀释即得其余所需浓度混悬液，高压蒸汽灭菌（0.103 MPa，20 min）。在加和不加S9的试验条件下进行平板渗入法试验。每组作3个平行皿，重复试验1次。-S9阳性对照物TA100用1.5 μg/皿的叠氮化钠，其余3个菌株均采用50.0 μg/皿的敌克松；+S9阳性对照物TA102用50.0 μg/皿的1,8-二羟基蒽醌，其余3个菌株均采用10.0 μg/皿的2-氨基芴。每组加入阳性对照的体积为0.1 mL。

1.3.4 小鼠骨髓细胞微核试验

采用昆明种小鼠50只，体重25～30 g，雌雄各半。将小鼠随机分为5组，每组10只，雌雄各半。试验设计：设10.0，5.0和2.5 g/（kg·bw）为3个剂量组，另设溶剂对照组（蒸馏水）及环磷酰胺阳性对照组[CP，40 mg/（kg·bw）]。样品配制：称取20.0 g样品加蒸馏水至40 mL，混合均匀作为高剂量，取20 mL高剂量混悬液，用蒸馏水依次倍比稀释作为中、低剂量，用蒸馏水作为溶剂对照。另外取0.04 g CP加蒸馏水至20 mL，溶解，备用。灌胃体积按2 mL/（100 g·bw），试验采用30 h灌胃法，2次间隔24 h，于第2次给样品后6 h取股骨骨髓涂片，固定，Giemsa染色后，在油镜下每只小鼠计数1 000个嗜多染红细胞（PCE）中的微核细胞数，计算微核的千分率。观察200个嗜多染红细胞中成熟红细胞数，并计算嗜多染红细胞与成熟红细胞的比值（PCE/NCE）。

1.3.5 小鼠精子畸形试验

采用雄性昆明种小鼠50只，体重25～35 g，将小鼠随机分为5组，每组10只。设有10.0，5.0和2.5 g/（kg·bw）3个剂量组，另设溶剂对照组（蒸馏水）及阳性对照组[CP，40 mg/（kg·bw）]。样品配制：称取20.0 g样品加蒸馏水至40 mL，混合均匀作为高剂量，取20 mL高剂量混悬液，用蒸馏水依次倍比稀释作为中、低剂量，用蒸馏水作为溶剂对照。另外取0.04 g CP加蒸馏水至20 mL，溶解，备用。灌胃体积按2 mL/（100 g·bw），每日经口灌胃1次，连续灌胃5 d，于首次给样品后第35天，脱颈椎处死动物，取双侧附睾进行制片，经甲醇固定、1%伊红染液染色后，在高倍镜下每只动物计数1 000条完整精子，记录精子畸形数、畸形类型，并计算精子畸形率。

1.4 数据处理

采用SPSS 17.0 for Windows软件对数据进行统计分析，所有数据均以平均数±标准差（D）表示。小鼠骨髓细胞微核试验采用卡方检验，小鼠精子畸形试验采用秩和检验，30 d喂养试验数据经方差齐性检验。

2 结果与分析

2.1 复方颗粒制备

通过L9(34)进行正交优化试验，以感官评分为评价指标。结果如表3所示。

由表3可知，各因素影响感官评分的主次顺序为：葡萄籽提取物添加量＞木糖醇添加量＞越橘浓缩粉添加量＞蓝莓粉添加量。依据正交试验结果可知，最优配方为A2B1C1D3。

表3 正交试验结果

该优选配方组合未出现在正交试验组合中，因此对该配方进行工艺验证，并对制备成品进行感官品评。该优化配方的评分结果为43分，优于正交试验中任一组合。因此该优选配方A2B1C1D3结果可靠，即蓝莓粉30%、越橘浓缩粉1.5%、葡萄籽提取物1%、木糖醇32%。

2.2 急性毒性试验

18.0g/（kg·bw）的剂量给予大鼠灌胃后，大鼠生长良好、行为正常、反应敏捷、体重增加、无明显中毒症状，观察14 d动物无死亡。试验结束后解剖动物，大体观察肝、肾、脾、心、肺、胃、肠等主要脏器，均未见明显异常。结果表明，复方蓝莓越橘颗粒对大鼠急性毒性MTD大于18.0 g/（kg·bw），依据急性毒性分级标准，大鼠急性毒性为无毒级。试验结果如表4所示。

表4 复方蓝莓越橘颗粒对大鼠急性毒性试验结果（D）

表4 复方蓝莓越橘颗粒对大鼠急性毒性试验结果（D）

2.3 Ames试验

无论在加和不加S9的条件下，各剂量组的回变菌落数均未超过自发回变菌落数的2倍，无剂量关系。试验结果表明复方蓝莓越橘颗粒试验结果为阴性，无致突变遗传毒性。试验结果如表5和表6所示。

表5 复方蓝莓越橘颗粒Ames试验结果（第1次）（D）

表5 复方蓝莓越橘颗粒Ames试验结果（第1次）（D）

表6 复方蓝莓越橘颗粒Ames试验结果（第2次）（D）

表6 复方蓝莓越橘颗粒Ames试验结果（第2次）（D）

2.4 小鼠骨髓细胞微核试验

复方蓝莓越橘颗粒各剂量组小鼠骨髓细胞微核率与溶剂对照组比较，差异均无显著性（P＞0.05），阳性对照组的微核率均显著高于溶剂对照组（P＜0.01），各剂量的PCE/NCE值均在正常范围内，且各剂量组PCE/NCE值均不少于溶剂对照组的20%，提示复方蓝莓越橘颗粒对小鼠骨髓细胞微核试验结果为阴性，复方蓝莓越橘颗粒无染色体改变遗传毒性。试验结果如表7所示。

表7 复方蓝莓越橘颗粒对小鼠骨髓细胞微核试验结果

2.5 小鼠精子畸形试验

各剂量组精子畸形率与溶剂对照组比较，秩和检验差异均无显著性（P＞0.05），阳性对照组显著高于溶剂对照组，差异有显著性（P＜0.01）。试验结果表明复方蓝莓越橘颗粒对小鼠精子畸形试验结果为阴性，复方蓝莓越橘颗粒对小鼠精子无致畸作用。试验结果如表8所示。

表8 复方蓝莓越橘颗粒对小鼠精子畸形试验结果

3 结论

通过正交试验研究，确定复方蓝莓越橘颗粒最终产品配方：蓝莓粉30%、叶黄素2%、越橘浓缩粉1.5%、葡萄籽提取物1%、维矿预混料1%、木糖醇32%、麦芽糊精32.5%。经制备，成品外观均匀、风味口感良好。食用安全性试验表明，复方蓝莓越橘颗粒对大鼠急性毒性MTD大于18.0 g/（kg·bw），依据急性毒性分级标准，大鼠急性毒性为无毒级。Ames试验、小鼠骨髓细胞微核试验及小鼠精子畸形试验结果均为阴性。综上所述，复方蓝莓越橘颗粒配方工艺较为合理，且成品具有较高的食用安全性。