攀枝花苏铁珊瑚根共生放线菌鉴定及共生体养分吸收

魏玉倩，陈健鑫，郑艳玲，王 芳，马焕成，王国娟，伍建榕

（西南林业大学 a.云南省高校森林灾害预警控制重点实验室；b.国家林业和草原局西南地区生物多样性保育重点实验室，云南 昆明 650224）

攀枝花苏铁国家级自然保护区位于金沙江北岸的巴关河西坡及格里坪后山，属于典型的南亚热带半干旱河谷气候类型，日照较长，热量充沛[1]。该地区地势陡峭、河谷深切且地形封闭[2]。攀枝花苏铁Cycas panzhihuaensis是国家Ⅰ级保护植物，存活时间超过2 亿年，与熊猫和恐龙合称为“巴蜀三宝”[3]。起初仅生长在攀枝花的巴关河西坡附近，后来逐渐扩展到周围的宁南和德昌等地区，是东亚大陆最北的一种苏铁类植物，其能在海拔较高的干热河谷贫瘠的石质山地中扎根生存[4]。苏铁的根系可分为3 种类型：主根（tap root）、侧根（lateral roots）和珊瑚状根（coralloid roots）。珊瑚状根是一种高度特化的侧根，具有重复二叉状分支的负向地性根，成熟的珊瑚根位于土壤表层约2～3 cm 的位置[5]。目前，对苏铁珊瑚状根内生菌的研究大多集中在共生蓝细菌，研究指出共生蓝细菌是从根系的裂缝处侵染细胞并延伸至藻胞层[6]，但珊瑚状根的形成是否由放线菌形成，至今还没有明确的定论。Zheng 和Gong[7]利用高通量技术对攀枝花苏铁的根、种子、未受精种子、胚珠、花粉和土壤中微生物物种多样性和群落组成进行分析，结果表明，攀枝花苏铁根系中除蓝细菌外，放线菌也是一类重要的微生物类群，且不同组织中的微生物群落均有丰富的多样性。

植物内生放线菌是一类G+C 含量高的革兰氏阳性细菌，在寄主植物抗逆性、作物产量以及改善土壤肥力等方面具有显著的促进作用[8]。陆地生态系统中，氮素是影响植物生长发育的主要元素[9]。大部分氮元素贮藏于土壤有机物中，而植物仅可吸收无机氮源[10-11]。近年来研究发现无菌根化的植物具有能直接从土壤中吸收低分子量有机氮化合物的能力[12-15]，但是植物必须依赖于共生互作过程才能够吸收有机氮源[16]。目前国内外报道的固氮放线菌绝大部分是弗兰克氏菌，而鲜有关于其他放线菌的固氮效率及其作用机制的报道，造成了固氮放线菌菌种单一。本课题组前期构建了攀枝花苏铁内生放线菌16S rRNA基因克隆文库，结果表明珊瑚状根内放线菌种类较多，分布于放线菌纲的16 个属[17]，然而放线菌在苏铁吸收氮的过程中所发挥的作用尚不清楚。

本研究采用传统的分离培养方法对苏铁珊瑚状根的内生菌进行分离培养，然后将纯菌株接种至无菌苏铁苗根系，通过石蜡切片观察放线菌的定殖位置，并利用同位素示踪法研究氮素的吸收形式，旨在明确攀枝花苏铁与放线菌形成的共生体系及其对苏铁根系营养吸收的影响，为今后攀枝花苏铁的保育提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料

2019 年在攀枝花苏铁自然保护区采集30 份攀枝花苏铁珊瑚状根，将根表面的泥土洗净后用石蜡密封，运回实验室置于4℃冰箱中保存备用。

试验于西南林业大学温室试验基地（25°03′N，102°45′E）进行，该地区属亚热带高原季风气候。供试土壤类型为河沙。供试攀枝花苏铁种子由四川攀枝花苏铁国家级自然保护区提供，经灭菌河沙培育得到攀枝花苏铁无菌种苗（使用放线菌门特异引物经PCR 检测确定为无放线菌种苗，可进行后续试验）。

1.2 试验方法

1.2.1 攀枝花苏铁内生放线菌的分离与鉴定

攀枝花苏铁珊瑚根用清水洗净表面土壤，再用去离子水冲洗3 遍后置于超净工作台中。先用75%乙醇消毒60 s，其次用0.1%升汞浸泡5 min 后，再用无菌水漂洗3 次。把表面消毒好的样品用无菌剪刀剪成小块，置于无菌研钵中，加入无菌水，用研磨棒将其充分研磨成匀浆液，取匀浆液200 μL 均匀地涂布于高氏培养基上（预先添加制霉菌素25 mg/L、重铬酸钾25 mg/L 和萘啶酮酸25 mg/L），倒置于28℃培养箱中培养。待放线菌长出后，挑取单菌落于高氏一号培养基上划线纯化，并将菌株保存于斜面培养基上，4℃保存备用。将表面消毒过程中最后一遍的无菌水涂布于培养基平板上，培养21 d 后，观察是否有菌落生长，同时将其作为模板，通过菌液PCR 利用细菌通用引物验证其中是否含有杂菌，以此判断表面消毒是否彻底。

纯化获得的放线菌用高氏一号培养基活化培养10 d，采用CTAB 法提取放线菌的DNA，以16S rRNA基因通用引物（27F/1492R）[18]进行PCR 扩增，将PCR 产物送至昆明擎科有限公司进行测序。测序获得的基因序列与GenBank 数据库中的已知序列进行BLAST 比对，用Clustalx 1.83进行序列的多重比对分析，MEGA 6.0 软件构建Neighbor-Joining 系统发育树，确定放线菌的分类地位。

1.2.2 攀枝花苏铁无菌苗与放线菌共生体系的建立

纯化后的内生放线菌接种于高氏一号液体培养基中，于28℃恒温摇床中180 r/min 震荡培养10d，用无菌水调节菌悬液浓度为1×106cfu/mL。

试验设置4 个菌液处理：以浇施灭菌的高氏一号培养液为对照（CK）；浇施TB-6；浇施TB-7；浇施TB-10。每盆一株苗，每10 盆为一个重复，重复3 次。每隔一个半月浇施一次，每次浇施20mL。接种18 m 后对攀枝花苏铁种苗进行根系观察是否形成珊瑚状根共生体。采用石蜡切片法[19]观察苏铁与放线菌之间的共生结构中放线菌的定殖情况。

1.2.3 接种放线菌改变攀枝花苏铁对养分吸收

经共生培养18 m 后，将苏铁整株取出，用蒸馏水将表面泥土冲洗干净，用无菌手术刀将攀枝花苏铁地上部分和地下部分分开，置于105℃烘箱中杀青30 min，在75℃烘干48 h，分别称取地上部分和地下部分干重。全氮含量采用凯氏定氮法测定[20]；全磷、全钾含量的测定采用硫酸-双氧水消煮，钒钼黄比色法测定[21]。

1.2.4 接种放线菌改变攀枝花苏铁对氮素吸收

以Hoagland 营养液为基础营养液，其中氮素处理为：铵态氮（NH4+-N）（99.5%15N 富集率）、混合氮（NO3--N）（99.3%15N 富集率）和CK（蒸馏水），每种营养液中氮浓度相同。接种放线菌18 个月后，在攀枝花苏铁幼苗周围土壤中分别加入1 mL 含有15N 标记的氮素标记物，以蒸馏水为对照，每盆一株苗，每10 盆为一个重复，重复3 次。15N 标记后24 h 收集苏铁根系，用流水将表面泥土和附着物冲洗干净，用0.5 mmol 的CaCl2溶液浸泡30 min，最后用蒸馏水清洗。处理后的根系采用气体同位素标记质谱仪测定15N 丰度。

1.3 数据处理

采用SPSS 20.0 统计软件对数据进行分析，并采用LSD 在0.05 显著水平对样品差异显著性进行比较。

2 结果与分析

2.1 攀枝花苏铁珊瑚状根内生放线菌分离鉴定

经培养基平板及菌液PCR 检测发现植物组织表面消毒彻底，结果表明分离所得放线菌均为根内生放线菌。通过高氏一号培养基共分离到16株内生放线菌，选取3 株分离频率最高的菌株进行16S rRNA基因序列扩增，经1%琼脂凝胶电泳检测，扩增得到约1 500 bp 的特异性片段。PCR产物测序拼接后提交到GenBank 进行BLAST 相似性分析，同时构建系统发育树（图1），结果 表 明，3 株 优 势 菌TB-6、TB-7、TB-10 分 别为Streptacidiphulus griseoplanus、Streptomyces spororaveu、S.xanthophaeu。

图1 基于16S r DNA 序列利用邻接法构建的攀枝花苏铁珊瑚根3 株放线菌与22 个代表菌株系统发育树Fig.1 The phylogenetic tree based on the 16S rDNA sequences of three actinomycetes and the representative strain of twenty-two actinomycete groups by neighbor-joining method

2.2 攀枝花苏铁无菌苗与放线菌之间共生体系的建立

2.2.1 珊瑚状根的形成

由图2 可知，攀枝花苏铁无菌苗接种放线菌培养18 m 后，根系形态发生变化，处理组苏铁有二叉状分枝的珊瑚状根，对照组则无珊瑚根，结果表明攀枝花苏铁无菌苗与放线菌之间共生关系已经建立。接种不同的放线菌均能形成珊瑚状根，但不同放线菌接种后的珊瑚状根数量存在差异，接种TB-6、TB-7 和TB-10 分别形成的珊瑚状根数量为12、27 和15，表明接种放线菌TB-7 对攀枝花苏铁珊瑚状根的形成最为显著。

图2 接菌无菌苗苏铁18 m 后与对照苏铁根系珊瑚根形成比较（a 对照 b 接种TB-6 c 接种TB-7 d 接种TB-10）Fig.2 Comparison of the coralline root formation between the inoculated sterile Cycas and control seedlings after 18 months

2.2.2 珊瑚状根内放线菌定殖结构

珊瑚状根经石蜡切片后横切面呈圆形或不规则，从外到内依次由周皮、外皮层、藻细胞带、内皮层和中柱。周皮由疏松的细胞组成，外皮层由薄壁细胞组成，内皮层由长圆形且含有簇状晶体细胞核单宁异细胞的薄壁细胞组成。维管柱由3～4 层不规则细胞组成，细胞排列紧密。外皮层和内皮层上部分细胞被染成鲜红的菌丝团即为内生放线菌（图3）[22]。

图3 苏铁无菌苗接种放线菌18 m 后珊瑚根横切面显微结构示放线菌的菌团体（a 40×B 100×）Fig.3 Microstructure of the cross section of coralline roots after 18 months of inoculation with actinomycetes (a 40×B 100×)

2.3 接种放线菌对攀枝花苏铁生物量的影响

由图3 可知，接种放线菌对攀枝花苏铁地上和地下部分生物量的影响，与对照相比，接种3 种内生放线菌后均能显著增加攀枝花苏铁地上和地下部生物量，地上部分生物量平均增加了31%，地下部分生物量平均增加了66%。不同放线菌处理对于地上部分生物量的影响依次为TB-7 ＞TB-10 ＞TB-6 ＞CK，不同放线菌处理对于地下部分生物量的影响依次为TB-7 ＞TB-10 ＞TB-6 ＞CK，表明接种放线菌TB-7 对地上、地下部分生物量积累的影响最大，且主要增加地下部分的生物量，对照组CK 生物量平均值为32.45 g，TB-7 实验组为62.6 g，显著增加了93%（图4）。

图4 接种不同放线菌的苏铁干质量Fig.4 Dry weight of Cycas after the inoculation with different actinomycetes

2.4 接种放线菌对攀枝花苏铁养分吸收的影响

由表1 可知，接种放线菌对攀枝花苏铁全氮、全磷和全钾吸收的影响。接种放线菌对不同养分吸收均有一定的影响，且对全氮积累影响最为显著。放线菌TB-7 处理植株地上部分氮素含量显著高于TB-6、TB-10 和CK，地下部分氮素含量TB-7 处理高于TB-6、TB-10 和CK，说明接种放线菌对攀枝花苏铁氮的积累有一定促进作用，且TB-7 对植株氮积累作用最大。磷和钾含量也得到了相同的效果。

表1 接种放线菌对苏铁全氮、全磷和全钾含量的影响† Table 1 TN, TP and TK contents and biomass of Cycas after inoculation with different actinomycetes (g/kg)

2.5 接种放线菌对攀枝花苏铁氮素吸收形式的影响

由表2 可知，接种放线菌对苏铁氮素吸收形式产生了变化。接种放线菌主要促进铵态氮的吸收。对于地上部分而言，对照组的硝态氮和铵态氮的吸收比例为1∶1.3，接种放线菌后显著促进了氮素吸收，尤其是铵态氮的吸收，TB-6、TB-7 和TB-10 的吸收比例依次为1∶1.45、1∶1.67和1∶1.51。对于地下部分而言，对照组的硝态氮和铵态氮的吸收比例为1∶1.1，接种放线菌后显著促进了氮素吸收，尤其是铵态氮的吸收，TB-6、TB-7 和TB-10 的吸收比例依次为1∶1.69、1∶2.03 和1∶1.9。说明接种放线菌可以促进植物对铵态氮的吸收。

表2 接种放线菌对苏铁各部分15N 丰度的影响†Table 2 15N abundance of Cycas after actinomycetes inoculation %

3 结论与讨论

1）本研究从攀枝花苏铁珊瑚状根中分离得到的放线菌，通过16S rRNA 基因序列发育分析，3 株优势菌TB-6、TB-7、TB-10 分别鉴定为Streptacidiphulus griseoplanus、Streptomyces spororaveu、S.xanthophaeu。

2）从攀枝花苏铁原生地分离的放线菌在实验室能使攀枝花苏铁幼苗形成珊瑚状根，主要定殖于外皮层和内皮层。

3）接种放线菌能够增加苏铁地上和地下部分生物量的积累，其中菌株TB-7 对地上、地下部分生物量积累的影响最大，且主要增加地下部分的生物量。

4）接种放线菌能够促进苏铁对氮磷钾的吸收，其中主要促进铵态氮的吸收。

3.1 攀枝花苏铁内生放线菌多样性

植物根内生菌主要由Proteobacteria、Acidobacteria、Actinobacteria、Bacteroidetes、Firmicutes 等细菌门构成，主要的优势种属包括根瘤菌属（Rhizobium）、伯克氏菌属（Burkholderia）、链霉菌属（Strephtomyces）、肠杆菌属、假单孢菌属、芽孢杆菌属等[23-25]。植物内生放线菌是植物内生菌中重要的一员，是存在于植物各组织内而且不会引起宿主植物产生明显感染症状，并与植物长期共存的一类微生物[26]。放线菌作为一类种类丰富且功能强大的微生物类群，广泛分布于植物的根、茎、叶、花、叶和种子中，不同植物内生放线菌的多样性和群落结构在植物不同组织部位的分布存在着显著差异，其中以植物的根部组织分布为多[27]。目前有关内生放线菌的纯培养研究中，链霉菌属的成员占有较大的比例。雷艳娟等[28]从新疆13 种荒漠植物的根中分离到361 株内生放线菌，其中链霉菌属占88%。Dahal 等[29]通过分析16S rRNA和nifH基因，发现南达科他州荒地土壤中具有生物固氮能力的微生物有50%属于链霉菌属；平原[30]利用分离培养结合结瘤固氮基因对沙枣根瘤内生固氮放线研究指出，22 株放线菌具有固氮功能，1 株菌同时具有固氮基因和结瘤基因，同时通过16S rRNA基因分析证明了除弗兰克菌属外链霉菌也参与共生固氮作用。Verma 等从印楝的根、茎、叶部位共分离到55 株内生放线菌，其中大部分来自根部，Streptomyces占多数[31]。本研究中从攀枝花苏铁珊瑚状根内分离到的放线菌中链霉菌也占据较大比例，与前人研究一致。说明植物内生菌在不同的植物类群间存在一定的保守性，这些保守的内生菌类群可能与植物的内部环境及自身的物质成分有关，是进化过程中长期选择与适应的结果，内生菌的稳定定殖和相关功能可以维持植物健康和保持较高生产力[32]。

3.2 接种放线菌对植株生长的影响

植物生长所需的营养物质主要通过根系获得，而这些营养元素在土壤中的利用率有限，一些植物根系菌能够促进植物对这些养分的吸收[33]。植物内生放线菌可以促进植物生长和养分的吸收，是替代传统肥料的新资源。许多研究都表明，植物内生放线菌促进植物生长的机制可能涉及植物激素的产生、溶磷、铁载体等作用有关[34]。梁新冉等[35]从番茄根中分离到链霉菌属的内生放线菌NEAU-D1，经该菌处理过的番茄和黄瓜的根长、株高、全株鲜重、全株干重比对照均有所增加。利迪链霉菌（Streptomyceslydicus）通过增加豆类植物根瘤菌的数量和形态，从而加大植物对铁离子的吸收，达到促进植物生长的目的[36]。Hamdali等[37]研究解磷放线菌（Streptomyces griseus）能够增加植株芽和根的重量，显著促进小麦植株生长，同时有效降低腐霉菌（Pythium ultimum）对小麦的侵染。本研究中珊瑚根内分离到的放线菌可以促进植物对养分的吸收，同时形成了珊瑚状根，增加了根的表面积，进一步促进苏铁对养分的利用率。

3.3 珊瑚状根改变苏铁的氮素吸收形式

氮、磷、钾元素是植物生长所必需的营养元素，其中任一元素的缺乏或过剩都会影响植株的生长[38]。其中不同形态的氮源对于植物养分吸收具有重要意义，硝态氮和铵态氮是植物可以吸收和利用的无机氮形态，且适量的铵态氮对植物生长有显著促进作用[39]。植物的菌根形态对吸收有机氮具有重要影响，菌根可以提高植物吸收有机氮的能力[40]。欧石楠类菌根、外生菌根和丛枝菌根对植物氮营养的影响已经得到广泛研究[41-43]。本研究发现有放线菌的珊瑚状根倾向于吸收NH4+，与Majerowicz[45-46]和Liu[47]研究有珊瑚状根的苏铁属可以直接吸收土壤中的游离氨基酸相吻合。还与前人研究外生菌根真菌促进植物NH4+的吸收这一论断相符[48]。因此，本实验的推断放线菌能够转变宿主植物倾向于吸收的氮源吸收形式，氮源吸收量与放线菌的种类有关。放线菌改变了攀枝花苏铁在干热河谷存活的养分吸收策略，且选择性吸收NH4+，植物容易吸收的形式，提高了养分利用率。本研究中放线菌能够通过形成珊瑚状根和寄生建立互惠共生关系，从而增加苏铁地上和地下部分的生物量，能够更好地吸收氮磷钾养分，并且珊瑚状根能够促进了苏铁对铵态氮的吸收，为新型微生物肥料的研发提供了良好的菌种资源。后续研究中有必要进一步开展放线菌的促生活性成分的研究，为放线菌次生代谢产物的开发利用提供理论依据。