活体共聚焦显微镜在评估2型糖尿病患者角膜神经形态学变化中的临床应用

陈丽妃， 黄 慧， 沈朝兰， 陈 琦， 李 敏

糖尿病是一种全身代谢性疾病，糖尿病视网膜病变(diabetic retinopathy，DR)是最常见的眼部并发症，也是眼科医师关注的焦点。然而，糖尿病在角膜中亦会引起病变。据估计，在糖尿病这一终生疾病的整个过程中，47%～64%的糖尿病患者存在糖尿病角膜病变[1]。糖尿病角膜病变的组织生理功能改变包括角膜上皮细胞伤口愈合不良、角膜神经纤维形态改变、内皮细胞损伤及泵功能改变。活体共聚焦显微镜(in-vivo confocal microscopy，IVCM)检查是20世纪90年代发展起来的一项具有划时代意义的技术，具有快速、无创、高分辨、实时的特点，可以实现对活体组织的超微结构进行无创性检查，精准地获取和分析角膜各层面的二维图像和整个角膜的三维图像。本研究运用IVCM评估2型糖尿病患者角膜神经形态学变化，探讨其与DR的关系，以期为糖尿病早期周围神经病变的诊断提供了一种新型、灵敏和非侵入性的检测手段。

1 对象与方法

1.1研究对象 选取2017年12月至2019年12月确诊的2型糖尿病患者180例，于广西壮族自治区人民医院眼科行直接或间接眼底镜检查，根据其是否合并DR将其分为非糖尿病视网膜病变(non-diabetic retinopathy,NDR)组(90例，90眼)和DR组(90例，90眼)。纳入标准：(1)确诊2型糖尿病[2]；(2)角膜组织透明；(3)无眼部外伤及眼部手术史；(4)无角膜感染病变史；(5)无角膜接触镜佩戴史；(6)未服用过影响角膜代谢的药物；(7)无其他影响周围神经的全身非糖尿病病变。排除标准：(1)合并中枢或其他周围神经疾病；(2)合并恶性肿瘤；(3)合并结缔组织病；(4)营养不良；(5)合并慢性肝炎疾病；(6)合并甲状腺疾病等内分泌疾病；(7)合并精神心理疾病；(8)合并活动性眼病、青光眼、翼状胬肉、疱疹病毒角膜病变、其他角膜感染病变、角膜云翳、角膜斑翳、角膜白斑。另选择同期健康志愿者90名(90眼)作为对照组。三组年龄、性别差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。见表1。本研究获医院伦理委员会批准(编号：KY-G2R-2019-053号)，研究对象均知情同意参与。

表1 三组基线资料比较

1.2IVCM检查方法及观察指标 由具有丰富IVCM操作及临床经验的眼科医师采用Heidelberg Engineering GmbH生产的IVCM(Heidelberg Retina Tomograph-Ⅲ)进行检查。受试者取坐位，用0.5%盐酸丙美卡因滴眼液对受检眼进行表面麻醉，装置好一次性角膜接触帽，调整显微镜物镜位置，予开睑器打开双睑，受试者头部固定于显微镜物镜前，双眼按照指示灯方向注视正前方。检查者将显微镜物镜向前移动直到轻触角膜中央表面，逐渐推进镜头，逐层显示角膜各层组织。采集角膜上皮下神经丛图像8～10张存储，深度50～60 μm，每张图像观察的范围是400 μm×400 μm。从存储的图像中选择6张清晰度好，能反映角膜中央部位神经纤维丛的图像通过仪器自带软件进行分析：(1)角膜神经纤维密度(corneal nerve fiber density，CNFD)，每平方毫米内所有神经主干纤维数目；(2)角膜神经分支密度(corneal nerve branch density，CNBD)，每平方毫米内主干神经发出分支的数目。采用Image J软件分析图像角膜神经纤维长度(corneal nerve fiber length，CNFL)，每平方毫米所有神经纤维长度之和。整个过程大约需要5 min，过程中无受试者抱怨疼痛、不适或视觉障碍。

2 结果

IVCM检查见NDR组和DR组的角膜神经纤维的数量及分支较对照组减少，走行僵直。比较结果显示，NDR组和DR组的CNFD、CNBD和CNFL水平均低于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。DR组的CNFD、CNBD和CNFL水平均低于NDR组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表2，图1。

表2 三组CNFD、CNBD和CNFL比较

图1 IVCM检查角膜神经纤维所见

3 讨论

3.1目前糖尿病已成为社会公共卫生问题，其发病率逐年增长。据国际糖尿病联合会推测，2035年糖尿病患者人数将达到5.92亿人[3]。糖尿病并发症累及全身，轻则影响患者生活质量，重则危害患者的生命安全。其中DR、糖尿病肾病和糖尿病周围神经病变是公认的糖尿病微血管并发症[4]，对患者生活质量影响较大。早预防、早诊断可防止晚期并发症的发生[5]。糖尿病周围神经病变的诊断方法包括神经症状/神经缺陷评分、定量感觉测定、神经传导速度测定、皮肤活检检测等[6-7]，其中神经传导速度检查曾经被认为是诊断糖尿病周围神经病变的“金标准”。但是神经传导速度检查对于早期改变较小的无髓鞘神经纤维的检测敏感性较差，难以对早期糖尿病周围神经病变作出诊断。皮肤活检能够检测出糖尿病周围神经病变的早期损害，但其是一种有创性检测手段，难以在临床推广[8]。由于检测手段的局限，过去认为DR是最早的糖尿病微血管病变。然而，随着IVCM的问世，学者们对早期糖尿病微血管病变又有了新的认识，即糖尿病性角膜神经病变早于DR发生[9]。20世纪90年代，Cavanagh等[10]首次将IVCM技术应用于猫、兔及人体的角膜检测，开启了IVCM在眼科疾病诊治中的应用时代。目前，IVCM技术已发展得较为成熟，在眼科疾病诊断中的应用也越来越广泛[11-14]，可以实现对活体组织超微结构的无创性检查，在角膜的生理、病理及疾病诊断方面都具备以往检查方法、设备无可比拟的优势。

3.2人角膜包含源自三叉神经的感觉神经纤维和源自颈上神经节的交感神经轴突。基质神经束在其周围进入角膜组成上皮下神经丛，角膜神经在维持眼表功能和形态完整性方面具有关键作用，并起到保护和营养作用。在裂隙灯下，糖尿病患者的角膜看起来光滑且透明，但是在角膜内也可能存在亚临床变化。IVCM是一种快速、无创的眼科成像技术，具有800倍的放大倍数及1 μm的分辨率，可对角膜的细胞水平进行定量分析。在IVCM操作过程中，角膜接触帽需接触被检者的角膜，操作者在检查前需先进行充分的表面麻醉，并且做好安抚工作，让被检者能够更好地配合检查。检查时操作者动作需轻柔，不能挤压角膜，角膜变形会影像图像质量，采集图像时动作要迅速，尽量减少操作时间。操作结束后予抗菌眼药水滴眼预防感染。

3.3本研究结果显示，NDR组的CNFD、CNBD和CNFL水平均较对照组降低，与国内外相关研究[15-16]结果相似。提示在尚未发生DR之前，糖尿病患者的角膜神经纤维形态已有所改变，IVCM检查可提供良好的证据。本研究结果还显示，DR组的CNFD、CNBD和CNFL水平均显著低于NDR组，说明随着糖尿病病程的进展，角膜的神经纤维形态进一步受到损害。在健康和糖尿病性角膜中，IVCM对基底层下神经丛的评估显示出良好的可重复性[17]。

3.4目前认为高血糖介导的炎症反应和氧化应激是糖尿病性角膜神经病变的发生机制。晚期糖基化终末产物(advanced glycation end products，AGEs)是糖分子的非酶糖基化产生的反应性代谢产物，其是由高血糖症引起的[18]。研究表明，AGEs的积累可导致糖尿病性角膜神经病变[19]。AGEs及其受体引起氧自由基的形成和促炎性细胞因子的释放[20]。在这种状态下，神经生长因子(nerve growth factor,NGF)和鞘脂的产生受到阻碍。角膜神经纤维受损后患者的角膜敏感性降低，瞬目减少，进而使角膜上皮干燥，容易出现上皮点状缺失、上皮持续糜烂等，导致异物感、畏光、流泪、视物模糊等眼部症状的发生。当然，高血糖不仅损伤角膜神经纤维，还对角膜其余各层组织造成损害，如角膜上皮细胞密度降低、内皮细胞密度的降低和形态改变等[9]，引发一系列症状。

综上所述，IVCM检测对评估2型糖尿病角膜神经纤维亚临床病理方面具有巨大潜力，在出现DR前就能够快速、无创、精准地检测出糖尿病角膜神经纤维的改变，为临床诊断与治疗提供依据。