液体活检在乳腺癌诊疗中的研究进展

沈嘉悦， 唐小其， 周涛声， 潘登华(综述)， 李 富(审校)

乳腺癌是严重损害我国女性健康的恶性肿瘤[1]。如何在超早期诊断乳腺癌、动态评估乳腺癌治疗疗效及精准监测乳腺癌的复发转移是临床实践中的难点及热点。目前乳腺癌诊疗依赖宏观的临床资料，包括影像学检查、活检病理结果等，难以超早期评估和诊断病变。传统的组织活检方法受限于肿瘤的大小、取材部位的定位等条件。对于微小的肿瘤病灶发现不及时，导致病情延误甚至肿瘤转移，而侵入式的取材方式也给患者带来一定的风险(如出血和感染等)。液体活检作为一种新兴的肿瘤检测方法，主要通过无创或微创的方式对患者的血液、尿液、唾液等体液取样，检测所取体液中的肿瘤生物标志物，如循环肿瘤细胞(circulating tumor cells,CTCs)、循环肿瘤基因(circulating tumor DNA,ctDNA)、微小RNA(microRNA,miRNA)等来获得关于肿瘤的相关信息，用于肿瘤的超早期诊断及个体化治疗方案的制定、疗效的评估及随访。相较于传统的组织活检，液体活检具有采样风险小、限制少、准确性高、方便连续采样、动态监测等优点。在乳腺癌的诊疗中，主要通过检测患者血液样本中的CTCs、ctDNA等来实现对乳腺癌的精准诊疗[2]。

1 CTCs

1.1CTCs的定义 CTCs是指在肿瘤的形成和发展过程中，从实体肿瘤病变脱落并进入外周血循环的各类肿瘤细胞的统称[3]。CTCs一般由肿瘤的原发灶或者转移灶脱落，通过血管或淋巴管转移至外周血循环。它是一类具有完整生物活性的肿瘤细胞，包含了患者肿瘤的DNA、蛋白质组等信息，除了作为肿瘤标志物帮助诊疗外，还可以进行体外培养用于药物敏感度研究。CTCs存在于肿瘤发展的各个阶段，但由于从肿瘤脱落的细胞在进入到外周血过程中，容易受到机械因素、免疫系统和药物的影响而被损伤破坏，导致其进入到外周血的数量极少，且大小、形态不一，难以被检测和计数。CTCs的这一特性使其作为标准对乳腺癌进行诊断和预后评估时，需要利用多种技术对其进行富集和检测[4-5]。

1.2CTCs的检测方式与技术 目前用于富集和检测CTCs的新技术是基于CTCs的一种或多种特征，将其与周围的正常血细胞区分开，例如生物学特征(表面蛋白表达、突变的存在、特定基因的表达、生存力)或物理特性(大小、密度、酸碱度、电荷和可变形性)。目前常用的富集方法包括基于形态学的富集法及免疫磁珠法，前者价格低廉但缺乏特异性，免疫磁珠法又包括阳性富集法和阴性富集法[6]。由美国强生公司开发的CTC检测系统Cell Search主要利用肿瘤细胞表达上皮细胞黏附因子(epithelial cell adhesion molecule，EpCAM)在上皮起源细胞表面表达的一种蛋白质标记，通过使用EpCAM抗体包被的磁珠对CTCs进行富集[7]。同时美国食品药品监督管理局正在对新型液体活检技术Parsortix用于转移性乳腺癌患者的申请进行审查。与Cell Search不同的是，Parsortix利用细胞分离技术，尽可能地捕获所有类型的CTCs以及CTC簇。此外较为常见的还有CTC-iChip的负浓缩技术。这项技术首先使用覆盖表面蛋白(CD45和CD15)的磁性珠子来识别免疫细胞，以标记白细胞，以便当CTCs通过微流控芯片时洗掉红细胞、血小板、血浆蛋白和剩余的蛋白[8]。

1.3CTC簇 有学者发现外周血中以细胞簇状态聚集存在的CTCs可避免“失巢凋亡”，并且对细胞毒性药物具有更高的耐受性[9]。与孤立的CTCs相比，CTC簇在血液中更为罕见，但它们预测的肿瘤转移准确度是单个CTC的23～50倍。Wang等[10]对纵向收集的CTCs和CTC簇进行了时间依赖性分析，CTC簇比单个CTC增加了额外的预后价值，乳腺癌合并症患者的血液样本中如果发现较大的CTC簇则预示着更高的病死率。有研究通过尿激酶型纤溶酶原激活剂阻止了CTC簇的组装，成功地提高了乳腺癌小鼠模型的总体存活率，这是CTC簇用于相关治疗的首创[11]。也有研究表明，CTC簇在肿瘤的转移中起到关键的作用，转移的发展在一定程度上取决于CTC簇的大小和数量[12]。然而，目前只有少数设备能检测CTC簇[13-14]。近年来，检测CTCs的技术快速发展，随着技术的进步，CTCs的作用机制将进一步阐明。CTCs有望作为评估转移性乳腺癌患者预后的独立预测因子，对超早期乳腺癌的诊断及微小病灶的发现同样具有重大意义[15-17]。

2 ctDNA

2.1ctDNA的定义 在细胞的凋亡和坏死过程中，释放到血液中游离的DNA片段称为循环基因(circulating free DNA，cfDNA)[18]。癌症患者血液中部分cfDNA与肿瘤来源的DNA一致，具有与肿瘤相同的基因和表观遗传学改变[19]，称之为ctDNA，其主要来自肿瘤坏死。除此之外，肿瘤细胞凋亡、肿瘤细胞直接分泌，以及已经被巨噬细胞包裹的坏死性恶性肿瘤细胞也可以释放ctDNA。相较于CTCs分析培养可以完整地显示出具有RNA和DNA大分子及蛋白质的整个癌细胞，ctDNA包含的信息仅限于基因及其变化，包括基因突变[20]。在肿瘤细胞的凋亡和坏死过程中，可从ctDNA中获得肿瘤DNA本身的点突变、重排、扩增等信息，因为从理论上说，ctDNA含有与肿瘤DNA完全相同的片段[21]。同时，ctDNA比CTCs更为敏感，更易被检测出来，已经证实在没有任何CTCs的情况下，ctDNA也可以在血浆中被检测出来。

2.2ctDNA与cfDNA ctDNA的半衰期为15 min～2 h，可用作动态的肿瘤标志物，以实时准确监测肿瘤负荷，评估乳腺癌新辅助化疗疗效等。ctDNA片段的大小在70～200 bp，通常大于非肿瘤的cfDNA[3]，并且大约只占cfDNA的0.01%。在健康人群中，cfDNA的血浆浓度范围为3～15 ng/ml，但在晚期癌症患者中，cfDNA的血浆浓度范围上升至10～1 000 ng/ml。ctDNA/cfDNA的比例取决于肿瘤和免疫学因素，包括肿瘤进展、肿瘤负荷和血液清除机制等。从外周血提取出ctDNA后，通过检测其数量和基因组成等，可以达到对肿瘤进行监测。但由于ctDNA的半衰期较短，若机体处于炎症或损伤状态时，大量cfDNA将被释放进入外周循环中，导致血液中的ctDNA/cfDNA比值下降，因此ctDNA受取样时间、温度以及患者体内除肿瘤外等因素影响较大[22]，从而要求ctDNA的检测方法有极高的灵敏度。

2.3ctDNA的检测技术与手段 ctDNA现有的检测技术未及CTCs成熟，主要有聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)技术和二代测序技术。PCR技术包括突变扩增系统(amplification refractory mutation system,ARMS)PCR、肽核酸钳制PCR、微滴式数字PCR(digital PCR,dPCR)[23]和BEAMing技术(基于小珠、乳浊液、扩增、磁性、结合dPCR以及流式技术的一种检测手段)[24]。dPCR只能分析有限数量的单个碱基对变化，并且通量相对较低，因此只能用于热点突变检测，而不能用于发现新突变。而ARMS方法目前已获得中国食品药品监督管理局批准用于临床ctDNA检测并广泛应用于临床。二代测序技术与PCR技术不同，二代测序不专注于检测热点突变，而是扫描更大区域的基因组变化，它能同时对上百万个DNA模板的序列进行测序，并且能够快速识别ctDNA中肿瘤来源的变异。灵活运用这两项技术可以同时在一个或多个样本中研究多个目的基因。当二代测序已经通过分析找到肿瘤特定基因组改变时，可以运用PCR技术对该特定基因进行热点突变检测，进一步提高ctDNA检测的效率和准确率。

2.4ctDNA的临床应用 ctDNA的临床应用包括转移性疾病的早期发现，治疗开始前及治疗后评估预后的价值。对于乳腺癌而言，携带ctDNA的体细胞突变具有潜在的敏感性和特异性，使ctDNA可以作为肿瘤标志物用于乳腺癌实时检测。在晚期及转移性乳腺癌的ctDNA中，检测到的突变基因以ESR1、PIK3CA、TP53、REBB2等基因为主[25]。而对于无任何宏观转移证据的乳腺癌患者来说，ctDNA仍然可以作为评估乳腺癌是否转移的超早期监测指标，并且具有高度的特异性。同样，通过二代测序分析乳腺癌原发灶，以确定是否存在可能的基因组改变。在78%的肿瘤中至少检测到一种突变，然后通过单独的dPCR在血浆样品中追踪鉴定出的突变。在不同时间点至少可获得3个样本：在新辅助治疗之前，手术后以及随后每6个月进行一次基线随访。在基线随访中，69%的血浆样本中检测到ctDNA，与肿瘤分析非常吻合，并且中位数13.6个月内发现了残留疾病。该研究也验证了ctDNA预测乳腺癌转移和复发方面的价值。此外，乳腺癌患者的局部淋巴结中亦可检出ctDNA，表明对患者淋巴结行ctDNA检测对乳腺癌的诊断应有所帮助[26]。

3 miRNA

3.1miRNA的定义 miRNA是一种非编码性微小RNA，通常由21～25个核苷酸组成，在细胞增殖、分化、凋亡等众多过程中起到了重要作用，影响着肿瘤发生、发展[27]。细胞外囊泡(extracellular vesicles,EVs)，包括微泡和外泌体，是由脂质双层包围的纳米颗粒，在循环中不受酶降解的影响。EVs具有异质性，而较大的EVs，如凋亡小体(50～5 000 nm)或微泡(100～1 000 nm)大多含有片段DNA，较小的EVs如外泌体(30～150 nm)富含细胞类型特异性非编码、调节性微小RNA[28]，在细胞间的信息交流发挥作用[29]。外泌体释放RNA是细胞之间遗传信息交换的重要机制，miRNA由外泌体分泌到体液中，而位于循环中的miRNA非常稳定，可以方便地用作复杂疾病的信息性生物标志物。在正常组织和病变组织中，miRNA的表达谱呈现出很大的差异，并表现出特定环境下的特征，对血浆、血清和其他体液中循环miRNA的研究表明，与健康个体相比，循环中的miRNA在口腔鳞癌患者的体液中显示出不同的水平。外泌体释放的miRNA约占循环中无细胞miRNA总量的3%。由于miRNA的这种特性，因此miRNA可以作为液体活检中的一种标志物，用以乳腺癌的诊断及治疗[30]。

3.2miRNA的检测技术与手段 高通量miRNA测序技术可用于在外泌体中检测miRNA，而目前研究不能提供外泌体中详细的miRNA表达谱，因此只能大概进行对比辨别miRNA的来源及表达谱[31]。miRNA-195是乳腺癌生物标志物研究的miRNA之一。一项研究描述了miRNA在乳腺癌患者的全血中的表达明显高于对照组。来自同一研究组的另一项研究也证实，与其他类型癌症组成的队列相比，miRNA-195过表达的准确性仅能检测出乳腺癌患者，而不能检测患有其他类型癌症患者。同样，另一项研究中证实了与对照组相比，乳腺癌患者血清中miRNA-195显著过表达。而有研究表明，miRNA-193和miRNA-210在不同分子亚型的乳腺癌中亦有表达，且miRNA-210在抑制后可对乳腺恶性肿瘤的增殖，尤其是在侵袭性最强的三阴性人乳腺癌细胞增殖起调控作用[32]。还有miRNA-21和miRNA-221/222与新辅助化疗和雌激素受体阳性患者中的他莫昔芬耐药程度有关。miRNA与外泌体可以在基因表达谱层面上对乳腺癌进行分析，与CTCs及ctDNA通过检测数目及浓度进行诊疗相比，侧重点有所不同，能更精确地反映乳腺癌的个体化差异。然而，受限于目前基因谱数据的挖掘、miRNA检验方法的选择、数据分析的差异，miRNA应用于临床乳腺癌液体活检还有很长的道路[33]。

4 小结

CTCs在判断乳腺癌患者预后方面有着较大的优势，ctDNA则更利于动态追踪肿瘤的转移以及复发。miRNA作为新兴的液体活检肿瘤标志物，虽然还未能应用于临床，但也展现出其在乳腺肿瘤诊疗中的巨大潜力。目前液体活检的普及还面临着许多困难，如难以保持每次检测的精确度和灵敏度，检测结果尚缺临床上的统一标准。随着生物技术快速发展，液体活检在乳腺癌诊疗中的优势将更为明显，将广泛用于乳腺癌的超早期诊断、新辅助化疗疗效评估、术后复发转移的监测以及预后评估等。细胞微粒、血小板等其他肿瘤标志物尚待进一步研究。