胶质瘤中hsa_circ_0021350的表达情况及临床意义研究

邹小琼， 薛春红， 王 平， 王燕靖， 李 鑫， 刘 畅， 农蔚霞， 李 枫， 陈 芳， 张庆梅， 罗 彬， 谢小薰

胶质瘤是常见的原发性中枢神经系统肿瘤，占中枢神经系统恶性肿瘤的81%[1]。根据世界卫生组织(World Health Organization，WHO)分级标准，胶质瘤分为四级，其中Ⅰ～Ⅱ级为低级别胶质瘤，Ⅲ～Ⅳ级为高级别胶质瘤[2]。肿瘤发生是内外因素长期影响及多基因相互作用的结果[3]。由于胶质瘤早期症状隐匿，病情进展快，多数患者在确诊时已错失最佳治疗时机[4]。因此，进一步研究胶质瘤发病机理，探索潜在的特异性肿瘤标志物和有效治疗靶点，对胶质瘤的早期诊断和临床治疗具有重要意义。环状RNA(circular RNA,circRNA)是近年来非编码RNA领域的研究热点。Kun-Peng等[5]的研究发现hsa_circ_0081001可作为骨肉瘤诊断和预后预测的生物标志物，且效能优于碱性磷酸酶和乳酸脱氢酶；还发现血清中该circRNA的表达水平可动态反映骨肉瘤患者的病情变化。另一研究显示，circ-LDLRAD3联合癌抗原19-9(cancer antigen 19-9,CA19-9)诊断胰腺癌具有良好的敏感性和特异性[6]。还有研究显示胃癌患者血浆的hsa_circ_0000419表达水平与肿瘤分期、淋巴和远端转移、神经周围浸润显著相关，其有作为胃癌预后指标的潜质[7]。circRNA在胶质瘤方面的研究刚起步，有文献报道外泌体hsa_circ_0072083可通过增加Nanog同源盒转录因子促进替莫唑胺的耐药，这为改善替莫唑胺治疗胶质瘤的疗效提供了新思路[8]。鉴定更多circRNA的功能作用将可为肿瘤诊断和靶向治疗提供更多选择。本课题组的前期研究发现hsa_circ_0021350在胶质母细胞瘤组织中表达上调。鉴此，本研究旨在探讨hsa_circ_0021350在胶质瘤诊断和治疗中的潜在价值。

1 资料与方法

1.1组织标本来源 选择2016年1月至2022年5月在广西医科大学第一附属医院神经外科经手术获取的胶质瘤组织标本40例，正常脑组织标本10例。胶质瘤组织标本中高级别胶质瘤(WHO分级为Ⅲ～Ⅳ级)22例，低级别胶质瘤(WHO分级为Ⅰ～Ⅱ级)18例。其中男性22例，女性18例，中位年龄为42.5岁。纳入标准：(1)术后病理检查证实为胶质瘤；(2)术前未接受放疗或化疗；(3)临床资料完整。排除标准：(1)生命体征不稳定者；(2)合并其他肿瘤者；(3)合并严重的器质性疾病或凝血障碍者。正常脑组织标本来源于颅脑外伤行内减压手术患者。所有组织标本经手术切取后冻存于-80 ℃液态氮。通过医院病历系统收集所有患者的一般临床资料以及病理检查结果。本研究经广西医科大学第一附属医院伦理委员会批准(编号：20220098)，研究对象或家属均签署知情同意书。

1.2细胞株及细胞培养 人胶质瘤细胞株SF126购于国家生物医学实验细胞资源库，并在本实验室传代保存。使用含10%胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)和1%的青霉素/链霉素双抗的DMEM培养基进行培养，培养箱条件设置为：5% CO2，95%饱和湿度，37 ℃。

1.3总RNA提取及cDNA合成 采用Trizol法提取组织标本总RNA；采用RNA提取试剂盒(Vazyme，美国)提取细胞总RNA。采用超微量分光光度计(OSE-260)测定RNA纯度，选择260/280 OD值为1.8～2.0的样本，经HiScript Ⅱ Q RT SuperMix for qPCR(Vazyme公司，美国)试剂盒将其逆转录为cDNA。

1.4核糖核酸外切酶RNase R消化实验 应用核糖核酸外切酶RNase R验证circRNA的存在。提取胶质瘤细胞SF126总RNA，并将其分为2份，一份用RNase R消化处理(RNase R+)，将1 μl的RNase R加到2.5 μg的总RNA中，37 ℃孵育20 min后，70 ℃ 20 min灭活酶；另一份不做任何处理(RNase R-)。

1.5逆转录聚合酶链反应(reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR) 以上述(方法1.4)经RNase R+和RNase R-处理的RNA逆转录为cDNA，并以之为模板，应用发散引物(hsa_circ_0021350的引物)和收敛引物(sox6 mRNA的引物)分别进行RT-PCR，所用引物由上海生物工程股份有限公司合成，引物序列见表1。反应体系：2×Rapid Tap Master Mix 12.5 μl，ddH2O 9.5 μl，上、下游引物各1 μl，cDNA 1 μl。反应条件为95 ℃变性3 min，95 ℃ 15 s， 54 ℃ 15 s，72 ℃ 15 s，35个循环，72 ℃ 5 min，最后延伸。将RT-PCR产物经琼脂糖凝胶电泳进行可视化检测。

表1 引物序列

1.6实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,qRT-PCR) 应用hsa_circ_0021350的引物进行qRT-PCR(试剂盒购自Vazyme公司)。反应体系：2×ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix 10 μl，ddH2O 7.2 μl，上、下游引物各0.4 μl，cDNA 2 μl。反应条件：95 ℃预变性30 s，95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，40个循环。以GAPDH为内参，采用2-ΔΔCt法计算目标因子的相对表达量，均重复3次独立实验。

1.7TA克隆测序 将qRT-PCR扩增产物hsa_circ_0021350送上海生物工程股份有限公司进行TA克隆测序，检测产物的序列是否与circBase(http://www.circbase.org/)上的序列一致，以及确定hsa_circ_0021350中是否存在环化位点。

2 结果

2.1hsa_circ_0021350鉴定结果 通过circBase获取hsa_circ_0021350的序列，查询显示hsa_circ_0021350来自人类第11号染色体上sox6基因的第5和第6个外显子的反向剪接(NM_017508)，长度为242 bp(见图1ⓐ)。将hsa_circ_0021350和sox6 mRNA的qRT-PCR扩增产物的测序结果分别与circBase上的对应序列进行比较，结果证实这两种扩增产物是hsa_circ_0021350和sox6 mRNA，且hsa_circ_0021350存在circRNA专有的环化位点(见图1ⓑ)。

图1 hsa_circ_0021350在基因组及基因sox6的定位及环化位点确定图

2.2circRNA的环状特性鉴定结果 RNase R消化实验联合RT-PCR实验结果显示，在RNase R-组，发散引物和收敛引物均能扩增出目的基因，分别为hsa_circ_0021350(171 bp)和sox6(107 bp)，其琼脂糖凝胶电泳条带清晰明亮。在RNase R+组，仅发散引物可扩增出清晰的凝胶电泳条带，收敛引物扩增产物的凝胶电泳条带消失，提示线性sox6 mRNA被RNase R消化。进一步对比发现RNase R消化前后，hsa_circ_0021350的电泳条带无明显变化，提示hsa_circ_0021350对RNase R的抵抗性高。此外，基因组DNA(genomic DNA,gDNA)仅收敛引物可扩增出电泳条带，排除hsa_circ_0021350是基因重组产物的可能。见图2。

<>表示hsa_circ_0021350；><表示sox6 mRNA图2 RNase R-组、RNase R+组、gDNA组中hsa_circ_0021350与sox6的表达情况图

2.3胶质瘤组织和正常脑组织的hsa_circ_0021350表达水平比较 高级别胶质瘤和低级别胶质瘤hsa_circ_0021350的表达水平均高于正常脑组织，差异有统计学意义(F=15.368，P<0.001)，且高级别胶质瘤hsa_circ_0021350的表达水平较低级别胶质瘤更高，差异有统计学意义(P<0.05)。见图3。

图3 低级别胶质瘤、高级别胶质瘤和正常脑组织hsa_circ_0021350表达水平比较图

2.4胶质瘤组织hsa_circ_0021350表达水平与临床病理指标的关联性分析结果 以hsa_circ_0021350表达水平的中位数将胶质瘤患者分为高表达组和低表达组，分析结果显示，hsa_circ_0021350的表达与胶质瘤分级、ki67阳性率具有显著关联性(P<0.05)，但与患者年龄、性别、肿瘤大小、Karnofsky评分，以及P53、上皮膜抗原(epithelial membrane antigen,EMA)、胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein，GFAP)、O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶(recombinant O-6-methylguanine DNA methyltransferase，MGMT)等相关分子的表达情况无显著关联性(P>0.05)。见表2。

表2 hsa_circ_0021350表达水平与胶质瘤患者临床病理指标的关联性分析结果

3 讨论

3.1目前，临床上对于胶质瘤的治疗主要以手术治疗为主，辅以放射治疗和化学药物治疗，近年来这些治疗方式都取得了一定进展。然而，由于中枢神经系统肿瘤位置的特殊性，临床上常出现外科手术不能完全切除肿瘤情况。另外，术后残留的肿瘤细胞对放射治疗和化学药物治疗存在抵抗性，这使得胶质瘤的治疗效果不佳，患者的病死率和复发率仍然较高[9]。鉴此，近年来越来越多的研究提出通过靶向治疗提高胶质瘤患者的生存率，而目前一些靶向药物在胶质瘤治疗中初显良好的应用前景[10-11]。开发胶质瘤的靶向药物需要特异性的靶分子，寻找和鉴定潜在的靶分子，分析它们表达的特性及临床意义，可为胶质瘤的靶向治疗及诊断带来新思路。

3.2circRNA是一类在临床诊疗中具有应用前景的分子，早在20世纪70年代研究人员就在病毒中发现了circRNA，但当时认为这是一种错误的剪切产物[12]。近年来，随着高通量测序技术的发展，众多的circRNA被发现。circRNA的5′和3′端共价结合形成闭环结构，不受RNA外切酶影响，不易降解，比线性RNA更加稳定[13]。有研究显示，circRNA的半衰期中位值为18.8～23.7 h，而它们的同源线性RNA的半衰期中位值为4.0～7.4 h[14]。circRNA除了在生物体细胞内的稳定性之外，其在不同物种之间也显示出高度保守性，因此具有作为疾病诊断生物学标志物的巨大潜力。现已知有许多circRNA呈现组织特异性表达，主要通过可变剪接、转录调控、编码蛋白、抗病毒免疫反应和微小RNA(micro RNA，miRNA)海绵作用等方式在肿瘤的发生、发展中发挥重要的调控作用[15-17]。目前越来越多的研究表明，circRNA与神经系统肿瘤的发生和发展密切相关。Zhou等[18]发现hsa_circ_01844能促进胶质母细胞瘤细胞增殖和迁移，而上调hsa_circ_01844能诱导凋亡，对胶质瘤起抑制作用。还有研究显示，hsa_circ_0082375可通过调节Wnt7B促进胶质瘤的发展[19]。hsa_circ_CLIP2可通过miR-195-5p/高迁移率组盒3(high mobility group box 3,HMGB3)轴调控胶质瘤生长[20]。

3.3本课题组前期对5例正常脑组织和5例胶质母细胞瘤中进行了高通量测序，共筛选出了879个差异表达的circRNA，包括224个高表达的circRNA和655个差异性低表达的circRNA，其中hsa_circ_0021350是差异性高表达的circRNA，且目前国内外均未见有相关文献报道。故本研究采用qRT-PCR检测hsa_circ_0021350在胶质瘤中的表达，并分析其临床意义，以探究其在胶质瘤临床诊断和治疗方面的作用。对于qRT-PCR技术而言，引物特异性至关重要，因此本课题组首先通过克隆测序确认了所采用的发散引物所扩增的qRT-PCR产物为hsa_circ_0021350。鉴于circRNA与普通的线性RNA有不同特性，我们进一步通过RNase R消化联合RT-PCR实验证实了hsa_circ_0021350的环状特性及其稳定性。以上这两项鉴定确保了qRT-PCR法测定胶质瘤中hsa_circ_0021350表达结果的准确性和可靠性。本研究qRT-PCR结果显示，hsa_circ_0021350在胶质瘤组织中呈现高表达，提示hsa_circ_0021350可能与胶质瘤的发生、发展相关；进一步分析发现，hsa_circ_0021350的表达水平与胶质瘤分级、ki67阳性率具有显著关联性。ki67被广泛认为是一种潜在的增殖预后标志，有成为癌症诊断标志物的应用潜力[21-22]。ki67的阳性率越高，提示肿瘤恶性程度越高，患者预后越差[23]。这也提示hsa_circ_0021350可能与胶质瘤的增殖相关，可能是判断胶质瘤恶性程度和预后的潜在标志物。

3.4本研究也存在一些不足：(1)纳入样本量较少，未能分析患者的生存预后；(2)未能分析胶质瘤患者血液中hsa_circ_0021350的表达情况；(3)研究结果尚不够深入，hsa_circ_0021350的具体作用机制仍有待进一步探讨。

综上所述，hsa_circ_0021350在胶质瘤中高表达，且可能与胶质瘤的恶性进展相关，可能成为胶质瘤患者的有价值的诊断标志物及治疗靶标，但结论及具体机制尚需进一步验证。