慢性肾脏病患者淋巴细胞亚群的变化及其意义

朱小静，张 媛，孟梅霞

（陕西省西安市人民医院（西安市第四医院）西安 710004）

慢性肾脏病（chronic kidney disease，CKD）已经成为全球严重威胁人类健康的重大公共卫生问题。流行病学调查[1]显示，我国成年人群中CKD的患病率为10.8%，据此估计我国现有成年慢性肾脏病患者达1.2 亿例，由此造成了庞大的透析人群。虽然血液和腹膜透析这些肾脏替代治疗为CKD 患者的生活质量及存活时间带来了极大的改善，但与一般人群相比，这些患者的全因死亡率仍较高，特别是心血管疾病、感染及恶性肿瘤[2-3]。多项研究[4-6]证实，CKD 患者具有独特的全身性病理生物学改变，存在明显的免疫功能紊乱。免疫系统是机体内重要的防御系统，T 淋巴细胞亚群的辅助细胞CD4+/CD8+比例失调可影响人体免疫系统，导致机体免疫水平处于抑制状态而发生肿瘤、肝炎、自身免疫病等[7-9]多种疾病。B 淋巴细胞在机体体液免疫方面也发挥着重要作用。有研究[10]证实，B 淋巴细胞在终末期肾脏病（endstage renal disease，ESRD）过程中具有重要作用。NK 细胞在病毒、肿瘤、急性白血病等[11-12]多种疾病中发挥着重要的作用，其发生作用的机制已被充分认识。除了传统观点认为的代谢、血流动力学以及基因等[13]危险因素外，免疫因素也被证明在CKD 的发生、发展过程中发挥着重要作用。本课题旨在探讨CKD 患者在不同阶段免疫系统的变化趋势，以及与炎症指标C-反应蛋白（CRP）的相关性，从而为控制疾病并发症的发生发展提供新的思路。

1 对象与方法

1.1 研究对象

所有对象均来自西安市人民医院住院及腹透管理中心、血液净化中心，共91 例。以简化的肾脏病膳食研究MDRD 公式计算肾小球滤过率（glo-merular filtration rate，GFR），GFR［mL/（min·1.732）］=186×（Scr）-1.154×（年龄）-0.203，女性×0.742。根据GFR 进行CKD 分期，分为CKD3期（GFR 为30～59）、CKD4 期（GFR 为15～29）、CKD5 期（GFR＜15），CKD5 期按照治疗方式分为未行血液透析（NHD）、血液透析（HD）及腹膜透析（PD）。CKD3 期共22 例，男性12 例，女性10例，平均年龄（58.9±19.0）岁；CKD4 期共19 例，其中男性10 例，女性9 例，平均年龄（58.3±13.1）岁；CKD5 期共50 例，其中NHD 组14 例，男性8例，女性6 例，平均年龄（54±20.1）岁；HD 组18例，男性9 例，女性9 例，平均年龄（48.3±17.5）岁；PD 组18 例，男性9 例，女性9 例，平均年龄（46.6±15.0）岁。所有患者原发病均为慢性肾小球肾炎，同时符合以下条件：血压控制稳定；近3个月未合并感染、心力衰竭；近1 个月内未输血；无肝脏与结缔组织性疾病；非妊娠或哺乳期妇女；未合并心脑血管及造血系统等严重并发症及其他严重原发病；无严重精神疾病；未用免疫抑制剂等影响本实验检测结果的药物。若出现其中一项或多项与以上要求不符则无法入组。血透患者均符合尿毒症期诊断标准且已规律透析（3 次/周）3 个月以上，透析剂量每次4 h，使用低分子肝素抗凝，透析器膜均为聚砜膜，膜面积1.2～1.5 m2，血流量200～250 mL·min-1，透析液流量500 mL·min-1。采用低钙无糖透析液。腹透患者符合尿毒症诊断标准且已规律腹透3 个月以上，采用低钙腹透液，每日置换液量8 000 mL。

对照组20 例，源于我院体检中心的健康志愿者，其中男性12 例，女性8 例，平均年龄（48.9±11.4）岁，无高血压糖尿病史，无肝炎结核等疾病史，无相关免疫性疾病及近期感染史。该研究得到西安市人民医院伦理委员会的批准，所有参与调查的患者及志愿者均知情同意。

1.2 试剂和仪器

CD45-FITC/CD4-RD1/CD8-ECD/CD3-PC5、CD3-FITC/CD16+56-PE、CD3-FITC/CD19-PE、mouse IgG1- RD1/IgG1-ECD/IgG1-PC5（Beckman Coulter USA）；红细胞裂解液、固定缓冲液（FBS）、BD FACS Calibur 流式细胞仪、流式上样管（美国BD 公司）；盐酸盐缓冲液（PBS，由西安交通大学免疫组化实验室提供）；淋巴细胞分离液（美国Amresco 公司）；高速冷冻离心机、各种规格移液枪（德国Eppendorf 公司）；各种规格EP 管（湖北孝感市宏业医用仪器有限公司）；15 mL 及50 mL 离心管（美国Sigma 公司）；超低温冰箱（美国REVCO 公司）。

1.3 标本制备及流式分析过程

1.3.1 血常规及有关生化指标的测定 所有入选患者及志愿者晨起空腹抽肝素抗凝血2 mL×2管，促凝血3 mL×1 管（血液透析患者上机治疗前采血），抗凝血2 mL 送检验科行血常规检查（红细胞及血红蛋白），促凝血3 mL 送检验科行肾功、胱抑素-C、甲状旁腺素（PTH）及CRP 等检测。

1.3.2 流式T 细胞检测过程 取抗凝全血2 管各约100 μL，分别加单克隆四色抗体CD45-FITC/CD4-RD1/CD8-ECD/CD3-PC5 以及同型对照抗体mouse IgG1- RD1/IgG1-ECD/IgG1-PC5，室温避光反应15～20 min，加2 mL 稀释后的溶血剂，室温避光反应10 min，300 ×g 离心5 min，弃上清，以2 mL PBS 洗涤2 遍，最后加入0.5 mL PBS 立即上机检测。采用双平台法四色流式细胞术以CD45 设门后分析总T 细胞（CD3+）、T4 细胞（CD3+CD4+）和T8 细胞（CD3+CD8+）的百分含量，并计算CD4+/CD8+细胞比值。

1.3.3 流式B 及NK 细胞检测过程 取抗凝全血4 管各约100 μL，分别加单克隆二色抗体CD3-FITC/CD16+56-PE、CD3-FITC/CD19-PE（Beckman Coulter USA）及各自相应的同型对照抗体，室温避光反应15～20 min，加2 mL 稀释后的溶血剂，室温避光反应10 min，300 ×g 离心5 min，弃上清，以2 mL PBS 洗涤2 遍，最后加入0.5 mL PBS 立即上机检测。分析总B 细胞（CD3-CD19+）、NK 细胞（CD3-CD16+56）比例。采用BD Calibur 流式细胞仪检测，Flow Jo 流式细胞分析软件分析。

1.4 统计学方法

数据采用SPSS 16.0 统计学软件进行分析。计量资料以均数±标准差（±s）表示。多组间均数比较采用单因素方差分析（ANOVA），组间两两间比较采用LSD-t 检验。相关性采用Spearman’s秩相关分析。P≤0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 所有CKD 患者与对照组血常规及生化相关指标比较

与对照组相比，肌酐、尿素氮、胱抑素-C 等反应肾功能的指标均随着CKD 病程的进展逐渐升高，CKD5 组（NHD、HD、PD）增高最为明显（P 均＜0.05），CKD5 期中NHD 与HD、PD 者差异均无统计学意义（P 均＞0.05）；与对照组相比，CKD患者血红蛋白随着病程进展逐渐下降（P＜0.05），CKD5 组中NHD、HD、PD 间血红蛋白差异有统计学意义，以NHD 者下降最明显（P 均＜0.05）；与对照组相比，PTH、CRP 随着病程进展逐渐上升，CKD5 组（NHD、HD、PD）增高最为明显（P 均＜0.05），在CKD5 组中NHD、HD、PD 间PTH、CRP差异均有统计学意义，以PD 组上升最明显（P 均＜0.05）。CKD 患者与对照组的性别、年龄均无统计学意义（P均＞0.05），见表1。

表1 所有CKD 患者与正常对照组临床资料指标比较（±s）

表1 所有CKD 患者与正常对照组临床资料指标比较（±s）

与对照组比较*P＜0.05；与CKD3 组比较#P＜0.05；※与CKD4 组P＜0.05；与NHD 组比较＆P＜0.05；与HD 组比较§P＜0.05；与PD 组比较＄P＜0.05。

CKD5 组NHD（n=14）HD（n=18）PD（n=18）年龄/岁48.90±11.4058.90±19.0058.30±13.1054.00±20.1048.3±17.546.6±15.0性别（男/女）/例12/812/1010/98/69/910/8红细胞/（×1012/L）4.62±0.573.46±0.82*2.81±0.65*#2.55±0.68*#3.30±0.72*&2.89±0.69*#血红蛋白/（g·L-1） 135.00±15.50104.00±26.00*82.8±18.10*77.50±12.70*#101.00±21.30*※&85.30±20.00*#肌酐/（μmol·L-1）69.60±11.60267.20±112.30*556.6±80.30*#983.40±372.70*#※ 897.30±242.20*#※ 851.60±218.00*#※尿素氮/（mmol·L-1）4.30±0.9314.50±7.01*20.00±5.94*#25.80±9.50*#※26.10±7.64*#※20.70±8.12*#胱抑素-C/（mg·L-1）0.77±0.163.42±1.90*5.31±1.86*#5.84±1.94*#8.22±4.10*#※&$6.06±1.09*#尿酸/（μmol·L-1）276.00±89.40 400.70±136.40*370.70±108.10*412.20±158.40*400.20±83.80*434.20±119.80*PTH/（pg·mL-1）38.00±14.80129.30±131.70*203.80±87.10*274.70±129.20*#397.30±349.50*#※ 319.50±136.90*#※CRP/（mg·L-1）6.80±0.6612.60±0.78*15.70±0.58*18.20±0.46*#19.40±0.57*#15.70±0.61*项目对照组（n=20）CKD3 组（n=22）CKD4 组（n=19）F/χ2 值1.919 3.175 10.905 13.827 19.403 23.481 18.778 14.940 16.482 14.372 P 值0.551 0.787 0.004＜0.001＜0.001＜0.001＜0.001 0.001＜0.001＜0.001

2.2 不同组间淋巴细胞亚群水平比较

与对照组相比，NHD 患者的CD3+细胞比例降低（P＜0.05），其余病例组与对照组差异均无统计学意义（P 均＞0.05）。与对照组相比，CKD 病例组患者的CD4+淋巴细胞比例均降低（P 均＜0.05），各病例组间差异均无统计学意义（P 均＞0.05）。CKD 各组CD8+淋巴细胞百分比及CD4+/CD8+比值与对照组相比差异均无统计学意义（P 均＞0.05）。与对照组相比，反应B 淋巴细胞比例的CD19+细胞比例随着CKD 病程的进展逐渐降低，CKD5组（NHD、HD、PD）降低最为明显（P 均＜0.05），HD、PD 及NHD 组间差异均无统计学意义（P 均＞0.05）。反应NK 淋巴细胞比例的CD16+56 细胞比例随着CKD 病程的进展逐渐增高，CKD5 组（NHD、HD、PD）增高最为明显（P 均＜0.05），HD、PD 及NHD者间差异无统计学意义（P＞0.05），见表2。

表2 不同组间T、B、NK 淋巴细胞水平比较（±s）

表2 不同组间T、B、NK 淋巴细胞水平比较（±s）

与对照组比较*P＜0.05；与CKD3 组比较#P＜0.05。

CKD5 组NHD（n=14） HD（n=18）CD3+/%73.20±4.3871.50±6.1470.30±5.81 63.60±8.30* 72.40±5.12 CD4+/%54.10±5.2941.60±4.68* 40.90±4.17* 42.10±6.50* 41.50±8.01*CD8+/%27.20±5.0824.10±9.6224.80±6.1122.60±5.31 24.90±7.12 CD4+/CD8+1.96±0.771.70±0.921.63±0.881.84±0.971.66±0.81 CD19+/%22.20±5.3813.50±4.14* 10.30±4.82* 5.60±5.32*# 6.40±2.15*#CD16+56/%8.50±6.1215.80±5.19* 16.50±3.84* 26.60±3.49*# 23.90±5.06*#项目对照组（n=20）CKD3 组（n=22）CKD4 组（n=19）PD（n=18）69.80±7.04 42.00±7.03*23.10±8.04 1.80±0.61 7.00±4.03*#24.80±6.01*#F/χ2 值1.236 19.778 1.382 0.896 22.473 9.798 P 值0.219＜0.001 0.176 0.412＜0.001 0.002

T 淋巴细胞流式细胞检测分析流程示意图：1）画FSC/SSC 点图，圈淋巴细胞门CD45；2）画CD3/CD8 点图，圈CD3+及CD8 细胞门；3）画CD3/CD4 点图，圈CD3+及CD4 细胞门。见图1。

图1 T 淋巴细胞流式分析流程示意图

B 淋巴细胞流式细胞检测分析流程示意图：1）画FSC/SSC 点图，圈淋巴细胞门；2）画CD3/CD19 点图，圈CD3+及CD19 细胞门。见图2。

图2 B 淋巴细胞分析流程示意图

NK 细胞式细胞检测分析流程示意图：1）画FSC/SSC 点图，圈淋巴细胞门；2）画CD3/CD16+56 点图，圈CD3+及CD16+56 细胞门。见图3。

图3 NK 细胞分析流程示意图

2.3 淋巴细胞亚群与CRP 相关性分析

CD3+、CD3+CD4+、CD3-CD19+细胞比例均与CRP 呈负相关（r=-0.273、-0.300、-0.323，P 均＜0.05）；CD3-CD16+56 与CRP 呈正相关（r=0.591，P＜0.01）。

3 讨论

本文结果显示，CKD 患者不但存在肾功明显受损，相关并发症如肾性贫血、肾性骨病相关指标亦存在明显异常，尤以CKD5 组中的各组变化最为明显，证实CKD 并非单一系统受损，而是使全身各系统受累的一种临床综合征。除了泌尿系统，CKD 患者常常存在全身各个系统的病变及异常，其中以心血管系统异常最为常见，且是致死的主要原因。同时，CKD 患者由于细胞损伤及氧化应激反应，导致患者长期存在微炎症状态，CKD组患者CRP 高于对照组，尤以CKD5 组的变化最为显著。

本研究结果显示，CKD 患者的CD4+T 淋巴细胞较对照组下降，说明T 淋巴细胞可能参与了CKD 疾病的发生、发展。Wherry 等[14]研究认为CKD患者长期存在微炎症状态，长时间的炎症信号改变了T 细胞的功能，从而导致其处于衰竭状态。Blank 等[15]亦认为，T 细胞在长期慢性刺激下会损害细胞因子的产生，如果炎症持续存在，将最终导致细胞耗竭。Liu 等[16]研究发现，尿毒症患者存在T 细胞异常且CD4+T 淋巴细胞促进慢性肾纤维化的进展。Chung 等[17]研究也证实CKD 患者T细胞相关的免疫系统发生明显改变，但在CKD中免疫紊乱变化规律及其引起疾病发展的机制并不明确。本文结果与有关研究结果一致[18-19]。Griveas 等[20]研究认为，CD4+明显下降可能是尿毒症毒素，尤其是PTH 对T 细胞功能抑制的作用；Bhasksran 等[21]认为其可能是由Fas/FasL 介导而导致T 细胞凋亡增加引起的；Meier 等[22]研究发现，在慢性肾衰竭患者中氧化的低密度脂蛋白通过Fas 机制激活了CD4+T 的凋亡。大量的研究[23-25]也证实T 细胞的凋亡与心血管疾病、慢性炎症及自身免疫性疾病密切相关，也是CKD患者死亡风险明显高于普通人群的主要原因，而通过调节免疫细胞来改善CKD 患者的预后可能具有重要的意义。

CKD 患者B 淋巴细胞较对照组下降，且随着肾衰竭程度的加重，B 淋巴细胞比例逐渐下降，表明B 淋巴细胞在CKD 的发生、发展中亦发挥了重要作用，慢性肾脏损伤造成免疫细胞下降，而下降的免疫功能进一步加剧了肾脏损伤的进展，二者互为因果，恶性循环。Pahl 等[10]研究认为，B细胞分化不良与白细胞介素17（IL-17）、B 淋巴细胞活化因子（BAFF）及其受体关系密切；Fernandez-Fresnedo 等[26]研究也证实在尿毒症中存在B淋巴细胞凋亡及分化不良，认为可能与抗凋亡蛋白Bcl-2 的减少导致凋亡增加有关，而肾替代治疗并不能明显纠正抗凋亡细胞的减少。同时也有研究[23]认为B 细胞可以调控T 细胞反应，二者关系密切，相辅相成，也进一步证实了CKD 患者免疫紊乱对预后的影响。

本研究结果显示，NK 细胞活性随着肾衰竭程度的加重而逐渐升高，而替代治疗组未见下降，这与Nishimoto 等[27]的研究结果一致，可能是尿毒症患者机体对执行特异性免疫功能的淋巴细胞数量下降的一种代偿机制或者是由机体的慢性炎性反应导致。本研究结果显示，免疫细胞变化与CRP 呈正相关，说明免疫系统与炎症的发生密切相关，证明CKD 患者存在明显的免疫系统紊乱现象，且多以免疫功能低下为主，由于CKD 患者存在免疫功能低下，因此容易引起感染及肿瘤发病的增加，且随着疾病进展，免疫紊乱持续恶化，使相关并发症的发生概率进一步增加，从而进入恶性循环，这也是尿毒症患者中感染及肿瘤高发的原因，其具体机制还有待进一步评估。

本研究还显示，血液透析对于纠正患者的免疫系统紊乱作用不明显，虽然透析治疗可以明显地清除患者体内的毒素及一些中小分子物质，维持患者电解质及酸碱平衡，使部分免疫细胞活性增强，进而延长和提高尿毒症患者的生存时间及质量，但血液透析患者可能存在因透析中失血而加重贫血、血流动力学不稳定、铝中毒以及透析器的生物相容性等多种多样的问题，并不能使免疫细胞的活性完全恢复，甚至可能加重患者的免疫功能紊乱。腹膜透析虽然在这些方面略优于血液透析，但由于其具有易导致蛋白丢失过多、葡萄糖摄入过量以及三酰甘油异常等缺点，故其纠正免疫紊乱的作用也不显著。从本研究结果中也可以看出，替代治疗仅代替肾脏清除水分及毒素，而肾脏的分泌功能、神经系统的调节是无法替代的，机体内其他系统的病变亦无法改善，因此并没有显著改善患者的免疫紊乱及炎症状态，想要改善患者的异常状态需要寻找新的途径。

综上所述，CKD 患者明显存在体液及细胞免疫的紊乱以及炎症状态，从而导致感染、心血管疾病及肿瘤等发病率增高，因此，改善CKD 患者的免疫功能及炎症状态对患者的治疗及预后极其重要。免疫功能状态是CKD 患者预后的重要因素之一，而肾脏替代治疗对于纠正免疫系统的紊乱作用有限，需要寻找新的路径来改善患者的免疫失衡及炎症状态，对延长患者生命、降低并发症发生率及提高生活质量具有重要意义。