长距彗星兰花蜜距石蜡切片的制备和显微结构的观察

崔以璨

(华中师范大学生命科学学院 湖北武汉 430079)

1 彗星兰的主要特点

兰科是仅次于菊科的单子叶植物中的第一大科，有2万多个物种和悠久的栽培历史，野生兰科植物的分布范围极为广泛的，大多集中在热带和亚热带。彗星兰(Angraecum)是兰科彗星兰亚族彗星兰属植物(图略)[1]，这种植物原产于非洲大陆的马达加斯加半岛，是那里所特有的。本文研究的是彗星兰其中的一个物种—长距彗星兰(Angraecum sesquipedale Thouars)，常被称为“达尔文兰”，其最突出的特点即是其唇瓣特化，有长达近30 cm的花蜜距。

长距彗星兰唇瓣向后延长呈管状，形成细长的花蜜距(图略)，长度可达30 cm。长距彗星兰花蜜距里面有腺体等结构，花蜜则是由此类腺体分泌而形成，花蜜在花蜜距的底部。

2 实验材料和研究方法

2.1 实验材料

本试验的试验材料为长距慧星兰，于2021年12月在上海辰山植物园温室内取得后移栽回华中师范大学9号楼。待植物生长状态稳定后采摘，在开放的新鲜花上取下花蜜距，将其浸泡在FAA固定液中保存后供实验使用。

2.2 研究方法

石蜡切片法的具体步骤如下：

(1)固定与洗涤:在自然界中获得的材料一般先放入FAA固定液中保存固定，直至需要使用时再取出。取出的材料要去除附着的固定液，以免影响后续的实验。该洗涤步骤用流动的蒸馏水冲洗，并在蒸馏水中浸泡2 h左右直至固定液被完全洗去。

(2)脱水:固定后的组织内充满水分，若不去除水分则后续的步骤如染色效果将不太理想。酒精即为最常见的脱水剂，按浓度梯度顺序进行浸泡脱去材料中的水分。将材料放入梯度酒精中浸泡1 h-2 h，再两次放入无水酒精中，每次脱水1 h-2 h。后续透明时二甲苯浸泡的材料块周围没有出现水雾状即为脱水完全，若透明过程中材料块周围出现水雾状则需要重新退回无水酒精中脱水。

(3)透明:配制无水酒精和二甲苯1：1等比混合的试剂，将脱水后的材料放入并浸泡1 h-2 h，再放入二甲苯中1 h-2 h[2]。

(4)浸蜡:将材料与1:1等量混合的二甲苯和石蜡一起放入小坩埚中，盖上盖子于42 ℃的烘箱内放置24 h；后将盖子打开，调温度为60 ℃，恒温24 h，此步骤的目的是让二甲苯蒸发；24 h后倾去原溶液，将材料转移至有熔融石蜡的小坩埚中，每隔1 h-3 h换一次纯蜡，共换三次。

(5)包埋:将石蜡与材料倒入纸盒，用镊子整理材料使材料切面向下，位置放正。将纸盒内石蜡倒满后，静置纸盒等待直至石蜡表面凝固出一层薄膜。将纸盒迅速放入冷水中使其凝固，然后反转纸盒将其压入水底，等待12 h后取出。

(6)切片与贴片:包埋好的蜡块拆去纸盒修整成立方体，用胶水将其底部贴附于小木块上，将处理好的小木块放入冰室冷冻片刻使包埋材料与木块间的粘性更强后取出。将木块夹紧，调整到方便操作的合适位置，将切片厚度设置为8 μm，向着同一个方向匀速转动切片机的摇杆，使切片连续不断的切下。

用镊子将切片夹到41 ℃水浴锅中，待切片自然展开后，用涂有蛋白甘油的玻片抄起，拨正位置后放入45 ℃烘箱中烘干直至石蜡熔化。

(7)切片脱蜡:将烤干的切片放入二甲苯溶液中，充分浸泡2 min，再重复上述操作一次，以便脱去玻片上材料周围的石蜡。

(8)复水:将切片依次放入梯度酒精和蒸馏水中各浸泡1 min-2 min。

(9)番红染色:配置浓度为1%的番红染液，将操作后的切片放入其中染色1 min-2 min。

(10)脱色:将切片放入梯度酒精中，每个浓度浸泡1 min。

(11)固绿染色:配置0.5%的固绿染液，将切片放入其中染色45s左右。后放入无水乙醇中脱色1min。此步骤结束后即可将玻片放在显微镜下观察植物的组织结构。

(12)封片:切片置于60 ℃烤箱中烤干，在二甲苯中透明5 min后滴加1-2滴中性树胶封片。

3 实验结果分析

3.1 横切面显微图

图1所示即为长距彗星兰花蜜距在光学显微镜4倍镜下观察到的整体横切图，长距彗星兰的花蜜距是管状结构，中间呈空心状。

3.2 表皮细胞

彗星兰是单子叶植物，内外两侧覆盖表皮细胞，起到保护的作用，内外两侧的表皮分别为上表皮和下表皮，根据观察可看出表皮细胞呈方形，外壁较厚，彼此互相嵌合，连接非常紧密，除了气孔之外没有任何间隙，如图2所示。为适应光合作用气体交换以及提高地上部水势的需要, 植物表皮细胞进化出通道, 逐渐形成气孔。根据观察图3圈出部位可以看到在花蜜距的内侧表皮上有一对哑铃型的细胞，那是单子叶植物表皮上的保卫细胞，一对保卫细胞中间出现椭圆形的裂口即为气孔。气孔的作用是调节和控制植物与外界环境之间的气体交换以及水分的散失。可以看出此时内侧表皮上的气孔是处于关闭状态的。

图1 花蜜距横切显微结构图

图2 花蜜距表皮细胞

图3 气孔

3.3 维管组织

观察图4可以看到花距横切显微图中有一圈染色较深的明显部分，在基本组织中分散着的各种细胞紧密结合形成的束状结构是植物的维管组织。因为彗星兰是单子叶植物，与双子叶植物无限闭合维管束不同的是单子叶彗星兰的维管束是有限的，维管束相互连接构成维管系统。维管组织包括木质部和韧皮部，起到一定的支持功能，并对植物适应陆生环境起到一定的帮助。木质部细胞大并且排列较为蓬松，这部分质地坚硬，自下向上的主要输导水分，同时与矿物质的运输有关。韧皮部细胞小并且排列紧密，这部分质地较韧，自上而下的主要运输有机养料，图4为光学显微镜下维管束中木质部和韧皮部具体结构示意图。

3.4 分泌组织

观察图5可以看到花蜜距内侧表皮有呈棒状的突起，疑似是表皮系统中起分泌作用的腺毛，腺毛是植物的一种外分泌结构。腺毛的种类繁多、形态各异，有防御作用、降毒作用，还可以合成、积累和储存各种类型的天然产物。

图4 维管组织

图5 表皮内的腺毛

4 思考与讨论

4.1 不足与反思

在切片过程中反复出现几个问题：第一是偶尔切片会变成小卷堆叠在切片机的刀片上，不成带。分析得知可能因为是室内的温度过低。因为室温及石蜡的熔点对切片的厚度有很大的影响[3]。切片较厚，高温的影响较小，切片愈薄，对高温愈敏感。第二是切片时蜡片不易连成蜡带，组织块易破碎,摊片时皱折多。根据实验室条件猜测是因为常用于浸蜡与包埋的石蜡中含有空气及杂质。有杂质和空气进入的石蜡往往韧性较差,硬度不适当。可以在石蜡中加入一定量的蜂蜡,可提高蜡块的硬度和韧度，切片时手感好, 易连片[4]。第三是切片向某一侧弯曲而导致不能形成直带，推测是因为蜡块在此之前并未修整成规整的立方体或者是蜡块与切片刀的刀面没有保持平行。第四是切片上出现裂纹，反思实验过程推测可能的原因是组织材料较硬或是在包埋的过程中石蜡冷冻太慢。实验中使用的番红染液的配制应选择用蒸馏水取代酒精，这样染色效果好，不易被褪色。洗去番红和固绿浮色时，因酒精对番红有分化作用，所以应避免时间过长，否则会导致染液颜色被褪色[4]。

本次实验的目的是为了观察到长距彗星兰花蜜距的内部组织结构。因此在一个玻片上应该放有多个连续不断的带有组织材料的石蜡切片，以便后续在显微镜下观察时可以看到花蜜距不同部位的结构特点，以此来比较材料不同部位组织细胞的相同和细微差别之处。比如花蜜距中应该有蜜腺的结构，但在染色后观察玻片时并未发现相关组织，考虑可能是切片时漏去蜜腺等其他部位从而导致观察的缺失。花蜜腺和腺毛一样是植物体常见的外分泌结构，在长期的物种进化演变过程中分化而形成的一类腺体。蜜腺根据其着生位置可分为花蜜腺和花外蜜腺。大多数兰科植物的香味十分浓郁或是蜜腺比较发达，这是因为它们要依靠特殊的气味或是分泌的花蜜来吸引传粉者。不同植物蜜腺的位置、形态、结构等都存在差异。

4.2 展望

本文通过石蜡切片实验对长距彗星兰的花蜜距内部组织结构进行了观察并分析其具体功能，可以观察到花蜜距的横切结构中主要有起保护作用的表皮细胞，起输导作用的维管组织，还有起填充作用的薄壁细胞等。前人对花蜜距的研究大多是基于生物个体水平上，对植物花部的特征进行描述和分类时有涉及到对花蜜距的描述，而对于花蜜距内部组织结构以及其相关生物功能的研究相对较少。

迄今为止，大多对花蜜腺的研究是对花蜜腺的发育解剖学研究和基于在电子显微镜下对超薄切片的观察，而对于花外蜜腺尤其是对于花蜜距内蜜腺的研究十分稀少。因此，在今后应该更加深入的对花蜜距内蜜腺的结构进行细胞以及分子水平上的研究，并加强对花蜜距内蜜腺作用机理的应用。