重组猪α干扰素对猪繁殖与呼吸综合征（PRRS）阳性血清中和猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）影响的研究

魏波，丛雁方，祝俊鹏，刘晓婧，蒋贻海

（青岛蔚蓝生物股份有限公司，山东 青岛 266114）

0 引言

干扰素是动物抵御病毒入侵的第一道防线，是动物机体感染病毒或接种疫苗后产生的一类具有抗病毒和免疫调节功能的蛋白[1-2]。目前将干扰素分为3类，它们根据核苷酸序列、与特定受体的相互作用、染色体位置、结构和物理化学性质进行分类[3]。 重组猪α干扰素（recombinant porcine interferon-a，rPoIFN-α）是利用大肠杆菌原核表达的一种重组蛋白，具有天然猪α干扰素抗病毒活性[4]。

猪繁殖与呼吸综合征（PRRS）是一种以母猪不孕、晚期胎儿木乃伊、流产、死胎和弱胎、对仔猪产出后发生呼吸道疫病和继发感染而很快死亡的传染病[5]。有报道重组猪a干扰素（rPoIFN-a）制剂可以治疗高致病性猪繁殖与呼吸综合征[6]。成功开发rPoIFN-α制剂，主要在体外细胞水平验证rPoIFN-α对PRRSV阳性血清中和PRRSV的影响作用，为rPoIFN-α应用在PRRSV防控和净化上提供数据支撑。

1 材料与方法

1.1 材料

猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）TCID50为10-6.89/mL、PRRSV阳性血清（中和效价为1∶37.6）、rPoIFN-α、Marc-145细胞、MDBK细胞由青岛蔚蓝生物制品有限公司保存。

1.2 方法

1.2.1 rPoIFN-a的活性测定

采用细胞病变抑制法。按常规方法将MDBK细胞传代，进行细胞计数，滴加96孔板。待细胞长至单层。用含2.0%血清的DMEM培养基将被检样品作10倍系列稀释，取10-4、10-5、10-6、10-7共4个稀释度，每个稀释度接种5孔，0.1 mL/孔，在37 ℃、含5% CO2培养箱中培养18～24 h。弃去上清液，每孔加入水疱性口炎病毒（VSV）0.1 mL（约100TCID50），另设病毒对照孔和正常细胞对照孔，各5孔；在37 ℃、含5% CO2培养箱中培养。待病毒对照孔75%以上细胞出现病变时，判定记录结果。按Reed-Muench法计算，能保护半数细胞不发生病变的最高稀释度即为干扰素效价（生物学活性）。比活性为生物学活性与蛋白含量之比。

1.2.2 rPoIFN-a增强PRRSV阳性血清对PRRSV病毒的中和作用

（1）PRRSV阳性血清工作液的制备。PRRSV阳性血清倍比稀释，选择2-5、2-6、2-7、2-8共4个稀释度试验。

（2）PRRSV病毒工作液的制备。PRRSV以无血清DMEM培养液稀释至2×105TCID50/100 µL、2×104TCID50/100 µL、2×103TCID50/100 µL、2×102TCID50/100 µL病毒滴度，即病毒工作液。

（3）rPoIFN-a工作液的制备。rPoIFN-a工作液稀释为20 000 U/mL。

（4）每个试验组作4个复孔，具体样品分组如下：①正常细胞对照组：200 µL/孔的无血清DMEM培养液。②PRRS病毒对照组：PRRSV病毒工作液100 µL/孔+无血清DMEM培养液100 µL/孔。③Ab组：PRRSV阳性血清100 µL/孔+PRRSV病毒工作液100 µL/孔。④IFN组：rPoIFN-a工作液（20 000 U/mL）100 µL/孔+PRRSV病毒工作液100 µL/孔。⑤Ab+IFN组：（PRRSV阳性血清50 µL+40 000 U/mL rPoIFN-a工作液50µL）100 µL/孔+PRRSV病毒工作液100 µL/孔。

（5）中和。将所有样品混匀后置37 ℃中和1 h。

（6）接种细胞。样品中和后每孔各取200 µL平行加入提前准备好的Marc-145细胞96孔培养板。置37 ℃、5% CO2细胞培养箱培养5～7 d，观察细胞CPE情况。

2 结果与分析

2.1 MDBK/VSV系统的rPoIFN-a活性测定结果

采用细胞病变抑制法，检测系统为MDBK/VSV细胞系统，通过重复试验计算出rPoIFN-a的活性效价为107.5U/mL。

2.2 rPoIFN-a增强PRRSV阳性血清对PRRSV病毒的中和作用

单独加IFN组可以中和103个TCID50PRRSV，Ab组中和效价1∶1.175可以保护103TCID50PRRSV感染孔没有病变。Ab+IFN组在1∶0.588和1∶1.175时均可以完全保护104TICD50PRRSV感染，同时保护3/4的孔数105TCID-50PRRSV未感染。由此得出，1∶0.588和1∶1.175的Ab+IFN组明显增强Ab中和病毒的能力，见表1。

表1 rPoIFN-a增强PRRSV阳性血清对PRRSV的中和作用

3 讨论与结论

rPoIFN-α在体内和体外对PRRSV均敏感，考虑干扰素可以作为抗病毒药物PRRS病疾进行紧急预防和治疗。猪感染PRRSV后，能使失活干扰素启动子刺激元件并且抑制干扰素调节因子的细胞核转位，抑制猪体内IFN-α/β的产生，使猪体内检不出IFN-α。体外试验证明IFN-α能抑制PRRSV在Marc-145细胞上增殖[7]。本研究结果同早期应用rPoIFN-α可以活化JAK-STAT通路，从而产生抗病毒蛋白抑制PRRSV的增殖结论相符。

本试验中每孔rPoIFN-α可以抑制103个TCID50PRRSV的增殖，PRRSV阳性血清在达到1∶2.35时也可以完全中和105个TCID50PRRSV病毒，但在PRRSV阳性血清中和效价在1∶0.588，协同加上rPoIFN-α，中和PRRSV的能力会保护到105个TCID50PRRSV病毒的3/4的孔数。其中可以看到单独加rPoIFN-α可以保护103个TCID50孔未感染。PRRSV阳性血清中和效价1∶1.175，试验孔的保护未感染趋势是一样的。由此得出rPoIFN-α会增强PRRSV阳性血清中和PRRSV的能力。