大学生综合创新实验：四苯基乙烯的聚集诱导发光特性研究及其指纹成像应用

张珮娟，赵博，何凤仪，罗寒飞，申起飞，党东锋

西安交通大学化学学院，西安 710049

荧光技术具有快速、灵敏及非侵入等优点，近年来在生物成像等领域中显示了非常广泛的应用前景[1]。其中，有机荧光材料具有结构可调、性能优异等特点，在上述领域中扮演着越来越重要的角色。然而，值得注意的是，传统的有机荧光材料由于存在强烈的分子间π-π堆积作用，致使其在固体等聚集状态下的荧光性能显著下降，即聚集导致荧光淬灭现象(Aggregation-Caused Quenching，ACQ，图1A)，这严重限制了该类材料的广泛应用。2001年，唐本忠院士团队提出了聚集诱导发光(Aggregation-Induced Emission，AIE，图1B)的概念[2]。与传统荧光材料的ACQ现象不同，具有AIE特性的荧光材料在溶液中以单分子形式存在，激发态能量主要是以非辐射跃迁的形式耗散，因此通常发出微弱的荧光甚至不发光；而当分子处于聚集状态时，分子内运动受限，非辐射跃迁耗散降低，激发态能量则主要通过辐射跃迁的方式回到基态，因而可以观察到优异的发光现象(图1C)。鉴于AIE材料的高效发光性能，近年来其受到了全球科学家的广泛关注[3,4]。据不完全统计，近10年来，共有来自中国、美国、日本、印度和新加坡等数十个国家和地区的研发人员发表了万余篇以“聚集诱导发光”为主题的科研论文，研究领域涉及化学、材料科学、物理、生物、医学和工程等多个学科方向，逐渐形成了以中国科学家引领，全球科学家竞相跟进的研究局面。聚集诱导发光作为目前的学术前沿研究热点之一，如何实现其在基础教学中的设计和推广，丰富和拓展大学生的研究视野，提高学生创新意识及培养创新思维，也是目前该领域需要深入研究的内容之一。

图1 传统有机荧光材料(A)和聚集诱导发光材料(B)在不同水含量四氢呋喃混合溶液中的发光强度示意图；聚集诱导发光材料的发光机理示意图(C) [3,4]

目前传统的实验教学主要以验证性实验为主，要求学生在联系和巩固理论知识的同时，实现动手操作能力的培养和提高，但是目前该类实验通常在创新意识培养方面具有一定的局限。2007年，教育部推行实施大学生创新实验计划，旨在探索和建立以问题为核心的实验教学新模式，通过结合多种多样的前沿和开发性创新实验，培养学生主动思考问题和主动解决问题的能力，最终全面提升学生的创新能力和实践能力。值得注意的是，学生在大学阶段能力和精力都相对较为有限，同时前期对创新实验的背景及内容了解不深。因此，如何设计出一个合适的综合创新实验，并且引导学生进行训练和深入研究是实现新时期培养目标的关键之一[5-9]。除此之外，如何实现大学生实验教学与思政教育相互结合也是目前需要思考的问题之一。基于上述考虑，本文提出一个新的大学生综合创新实验——四苯基乙烯的聚集诱导发光特性研究及其指纹成像应用，将前沿研究热点的聚集诱导发光概念引入实验教学，一方面通过中国人引领的研究内容讲解，加强和提升学生的民族和文化自信，激励学生更好地投身科研学习，实现创新实验和思政教育的互相融合；另一方面通过四苯基乙烯(TPE)化合物与4’,5’-二溴荧光素的性能对比及其光物理测试和指纹成像应用研究等，进一步丰富创新实验教学内容，提升教学效果。本综合创新实验的实施能够较好地拓展学生对聚集诱导发光等前沿研究和背景知识的了解，也能够加强学生对荧光光谱仪等仪器的掌握，可以极大地激发和提高学生参与实验的积极性，为培养和提高学生发现问题、解决问题的能力奠定基础，最终为大学生科研素养和创新思维等的养成提供新的探索思路。

1 实验目的

1) 通过查阅文献和资料，了解聚集诱导发光的机理、材料体系种类及其潜在应用领域；

2) 了解和掌握荧光光谱仪等仪器的工作原理及操作要点，练习并掌握上述仪器的数据处理和分析方法；

3) 提高学生查阅文献的能力，巩固和提高其实验技能，培养其发现问题和解决问题的能力，增强学生创新思维能力。

2 实验部分

2.1 实验原理

聚集诱导发光原理：目前聚集诱导发光的机理主要是分子内运动受限(图1C)，即AIE分子内部存在能够振动和转动的单元，当其处于溶液等单分子状态时，较多的分子内运动将导致激发态能量主要以非辐射跃迁的方式进行，此时荧光强度较弱；而当其处于固态等聚集状态时，上述运动受到了明显限制，激发态能量则主要以辐射跃迁的方式进行，进而发生强烈的荧光发射现象。

聚集诱导发光特性检测原理：配制四苯基乙烯的乙腈溶液，向其中加入不同比例的水(体积比)，得到一系列不同水含量的四苯基乙烯乙腈溶液。不同水含量条件下，四苯基乙烯的分子聚集程度不同，其中水含量越高，分子聚集程度越明显，其荧光发射强度越大。

指纹成像原理：本文主要采取以下两种方法进行指纹成像，并进行数据分析和对比。

1) 分散液提取指纹[10]：配制四苯基乙烯的水-乙腈混合分散液，分散液中存在的TPE聚集体会与指纹中残留的油脂结合发射荧光，进而显示出指纹的精细结构；

2) 指纹粉提取指纹[11]：将磁粉与TPE固体粉末混合制成指纹粉，利用指纹粉与手指分泌物中油脂的吸附作用，结合TPE的聚集诱导发光特性实现指纹提取与成像。

2.2 试剂或材料

四苯基乙烯(98%，艾伊津生物有限公司)，4’,5’-二溴荧光素(95%，阿法埃沙化学有限公司)，磁粉(广州市鹰洲科技有限公司)，乙腈(AR，天津市大茂化学试剂厂)，四氢呋喃(AR，天津市富宇精细化工有限公司)，二氯甲烷(AR，天津市富宇精细化工有限公司)。

2.3 仪器和表征方法

稳态/瞬态荧光光谱仪(FLS980，爱丁堡公司)，UV-A型手提暗箱式紫外分析仪(上海康和光电仪器有限公司)，旋转蒸发仪(RE-52AA，上海亚荣生化仪器厂)，循环冷却器(DL-400，郑州长城科工贸有限公司)，循环水式多用真空泵(SHB-IIIA，郑州长城科工贸有限公司)，天平(BSA223S-CW，赛多利斯科学仪器有限公司)。

2.4 实验步骤

1) 四苯基乙烯和4’,5’-二溴荧光素的聚集诱导发光特性测试。

称取3.3 mg四苯基乙烯固体粉末，并将其溶解在100 mL的乙腈中，得到四苯基乙烯溶液。量取上述溶液约0.4 mL，并加入3.6 mL乙腈，混合均匀配制水含量为0%的待测溶液(4 mL)；量取上述溶液约0.4 mL，依次加入3.2 mL乙腈和0.4 mL去离子水，混合均匀配制水含量为10%的待测溶液(4 mL)；量取上述溶液约0.4 mL，依次加入2.8 mL乙腈和0.8 mL去离子水，混合均匀配制水含量为20%的待测溶液(4 mL)；按照上述待测液配制方法，依次配制出水含量为30%、40%、50%、60%、70%、80%及90%的待测溶液，并保证浓度均约为1 × 10-5mol·L-1；在365 nm紫外灯照射下，观察上述待测溶液的发光现象，并利用荧光光谱仪测试上述溶液的荧光发射光谱，收集和处理数据，记录其最大发射波长。

称取4.9 mg 4’,5’-二溴荧光素固体粉末，并将其溶解在100 mL的四氢呋喃中，得到4’,5’-二溴荧光素溶液。按照四苯基乙烯的溶液配制方法，依次配制出水含量为0%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%和99%的待测溶液，并保证浓度均约为1 × 10-5mol·L-1；在365 nm紫外灯照射下，观察上述待测溶液的发光现象，并利用荧光光谱仪测试上述溶液的荧光发射光谱，收集和处理数据，记录其最大发射波长。

结合上述数据，对比四苯基乙烯和4’,5’-二溴荧光素两种材料的光物理性能特点，进而总结AIE和ACQ化合物的荧光性能区别。

2) 分散液提取指纹。

本实验首先提出利用四苯基乙烯的分散液提取指纹，并研究了水含量和浸泡时间对指纹提取及成像的影响，相关步骤如下。

探究水含量对指纹提取的影响：按照上述溶液配制方法，制备成10 mL不同水含量(40%、50%、60%、70%)的四苯基乙烯分散液；将指纹留于清洗后的盖玻片上后，将盖玻片轻轻放入装有四苯乙烯分散液的小烧杯中，让分散液完全浸没盖玻片，期间不断轻摇小烧杯，使四苯基乙烯吸附在指纹上，持续10 min；取出盖玻片，用去离子水冲洗后放在滤纸上晾干，并在365 nm紫外灯下观察指纹成像效果。

探究浸泡时间对指纹提取的影响：按照上述溶液配制方法，制备成10 mL水含量为60%的四苯基乙烯分散液；将指纹留于清洗后的盖玻片上后，将盖玻片轻轻放入装有四苯乙烯分散液的小烧杯中，让分散液完全浸没盖玻片，分别浸泡4 min、7 min、10 min和13 min后，取出盖玻片，用去离子水冲洗后放在滤纸上晾干，并在365 nm紫外灯下观察指纹成像效果。

3) 指纹粉提取指纹。

本实验也可以使用四苯基乙烯固体粉末与磁粉混合制备相应的指纹粉，利用指纹粉提取指纹，相关步骤如下。

指纹粉的制备：将四苯基乙烯(70 mg)溶于二氯甲烷中(20 mL)，并加入2.5 g磁粉。混合均匀并超声处理10 min后，用旋转蒸发仪减压去除溶剂，将得到的固体混合物用研钵进行研磨，使磁粉与四苯基乙烯粉末完全混合，将得到的粉末放在烘箱中干燥过夜后备用；

指纹提取及成像：将指纹留于清洗后的载玻片上后，取适量制好的指纹粉倾洒在指印上，轻拍载玻片使磁粉与指印充分结合，用磁棒去除未被吸附的磁粉，并在365 nm紫外灯下观察指纹成像效果。

3 结果与讨论

3.1 四苯基乙烯和4’,5’-二溴荧光素的光物理性能

如图2A所示，四苯基乙烯在乙腈溶液中几乎不发光，但是随着水含量的不断增加，其聚集程度逐步加强，荧光强度也得到了缓慢提升，最终在水含量为90%的乙腈溶液中显示了非常强烈的荧光发射现象。由图可知，四苯基乙烯溶液的发射波长大约在400-600 nm范围内，并且其在固态下也具有强烈的荧光发射信号。四苯基乙烯分子在不同水含量乙腈溶液中的相对荧光强度及荧光照片也再次显示了其良好的聚集诱导发光特性(图2C)。另一方面，4’,5’-二溴荧光素在四氢呋喃溶液中可以显示出一定的发光现象，随着水含量的不断提高，虽然其荧光强度略有提高，但是当水含量为95%和99%时，其荧光发生了明显的淬灭现象，尤其是4’,5’-二溴荧光素在固态下的荧光信号几乎完全淬灭(图2B和图2D)，这也证明了其聚集导致荧光淬灭的特点。上述结果显示，相较于传统荧光材料，四苯基乙烯具有优异的AIE特性，显示了其在指纹成像等领域中的巨大应用潜力。

图2 四苯基乙烯(A和C)和4’,5’-二溴荧光素(B和D)在不同水含量乙腈或四氢呋喃混合溶液中的发光光谱图(A和B，插图为其分子式)及其相对荧光强度变化图(C和D，插图为其不同条件下的荧光示意图)

3.2 分散液提取指纹

本实验首先研究了四苯基乙烯分散液中水含量对指纹成像性能的影响(图3，A-D)。如图所示，在水含量为40%和50%的四苯基乙烯分散液中，由于其有机溶剂含量较多和聚集程度有限，导致指纹成像效果较为有限。当水含量上升为60%和70%时，浸泡10 min的指纹样品可以较好地吸附四苯基乙烯聚集体，实现较好的荧光发射及成像效果。另一方面，本实验也研究了分散液提取时间对指纹提取及成像的影响(图3，E-H)。研究发现，当指纹样品分别浸泡4 min、7 min、10 min、和13 min后，浸泡7 min的指纹样品成像效果最好，能够较好地分辨出指纹的二级结构。

图3 待测指纹样品在四苯基乙烯分散液中的荧光成像示意图(A-D)；待测指纹样品在四苯基乙烯分散液中(水含量为60%)的荧光成像图(E-H)

3.3 指纹粉提取指纹

本实验也采取了第二种方法，即利用四苯基乙烯指纹粉提取指纹并进行成像。首先将制备好的指纹粉与指印充分结合，当去除未被吸附的指纹磁粉后，即可在365 nm紫外灯下观察指纹成像效果(图4)。由图可见，利用该法可以实现较好的荧光成像效果，尤其是可以清晰地观察出指纹的精细二级结构(图4，B-E)。除此之外，该指纹样品在存放3天后，仍然能够显示出优异的成像效果，显示了较好的成像稳定性能(图4，F)。

图4 待测指纹样品与指纹粉共混后的荧光成像示意图(A：第一天；F：第三天)及其二级潜指纹成像结构(B-E)

3.4 指纹成像性能分析

为对比两种指纹提取方法，并进一步分析其荧光成像效果，本实验也利用image J软件对两种方法所得的荧光照片进行灰度值分析(图5，白线部分)[8]。如图5所示，两种指纹提取方法都取得了较好的波峰波谷差距，显示了良好的成像分辨率(图5)。然而，使用分散液提取的指纹，其荧光亮度分布不均匀，且有机溶剂的存在对指纹的精细结构也具有一定的破坏作用。同时，值得注意的是，此法也具有一定的批次差异性。另一方面，利用指纹粉提取指纹的方法相对较为简单，不需要严格控制提取时间，且具有较好的成像稳定性，显示了较好的应用前景。

图5 待测指纹样品利用四苯基乙烯分散液(A)和指纹粉(C)得到的荧光成像示意图及其对应的灰度分析图(B和D)

4 实验安排与教学建议

本实验前期已经组织了2-4名本科生进行了相关综合创新实验训练，大约耗时8 h，其大致实验进度安排如表1所示。首先由教师进行实验背景介绍，使学生对聚集诱导发光材料及其应用研究有进一步了解，尤其通过中国人引领的研究前沿讲解，加强和提升学生的民族和文化自信，实现创新实验和思政教育的相互融合；溶液配制部分由学生单独操作，要求其联系基础实验中的教学内容，在约1 h内完成；因需要使用荧光光谱仪，光谱测试部分建议分组进行，3-4人为一组，在教师讲解原理及操作流程之后，由学生操作完成；指纹粉制备环节需要保证四苯基乙烯分子与磁粉充分混合，并确保颗粒均匀；指纹粉提取与成像部分要求学生单独操作，并利用两种方法进行对比和分析；在实验完成后也要求学生当堂进行实验数据分析及报告初步撰写，并进行实验结果讨论，分享自身心得体会，为本综合创新实验的下一步改良和教学效果提升提供建议。

表1 本综合创新实验的时间进度安排表

为了进一步实现本实验在高校的实施和推广，我们也建议应适当加强综合创新实验的管理及实验评价等方面的工作，相关建议如下：

1) 实验管理与实施。

本综合创新实验的指导和管理要求必须坚持学生的主体作用，教师则以辅导为主。首先，由教师面向大二和大三学生发布指南，学生根据自己的时间报名参加；实验开展前，学生根据指南分组，自行查阅相关文献，了解实验设置的目的及意义，并对实验内容形成初步了解。学生若对实验内容有补充或者不解，也可与教师讨论实验方案，补充实验内容，并验证其可行性，在实验开展前确定最终实验方案；实验过程中，首先由教师对背景及内容进行简单梳理，之后则主要以引导为主，辅以有效监督，要求学生自己动手、自己思考，尤其要求其详细记录实验步骤及数据，不可随意修改，培养学生实事求是的科学态度；实验结束后，要求学生整理和分析数据，并完成实验报告撰写，同时对综合创新实验的管理和实施提出建议。

2) 实验考核与评价。

实验的评价和考核对于教学目标的实现至关重要。本综合创新实验强调目标性考核与过程性考核的兼顾和平衡。如在注重培养和教学目标的同时，加强关注学生在实验过程中的收获，如完成了哪些创新性实验内容、在实验团队中具体扮演什么角色、遇到问题时提出了哪些好的解决方法、在实验过程中有什么新的思路和想法等；此外，实验的评价也需要一方面坚持评价的指标化，另一方面坚持评价的个性化。如在化合物光物理测试及指纹成像分辨率的计算和分析等方面需要坚持指标化，但在开放式讨论及心得体会分享方面注重个性化，注重对学生科研思维和创新思维等的启发，尤其培养其对科学研究的兴趣。本综合实验也建议通过多方位互相结合，完善考核和评价机制，进而更好地评价教学效果。

5 思考题

1) 查阅文献和资料，找出几类经典的聚集诱导发光材料，并总结其结构特点和潜在应用；

2) 阐述荧光光谱仪的操作要点及注意事项，并列举荧光材料光物理测试的其他性能指标及测试方法；

3) 查阅文献，找出其他可用于指纹成像的材料体系，分析其结构特点和利弊，并简单提出高性能指纹成像材料的设计思路。

6 结语

本文结合当前荧光材料的研究热点，提出了四苯基乙烯的聚集诱导发光特性研究及其指纹成像应用的大学生综合创新实验，通过四苯基乙烯的光物理性能测试和指纹成像应用丰富了创新实验的教学内容。实验的实施不仅会进一步提高学生对聚集诱导发光领域的了解，同时也有利于加强其对荧光光谱仪等大型仪器设备的掌握，在提高学生动手能力的同时，为其科研素养和创新思维能力的提升奠定基础。本综合创新实验也可以结合思政教育，激发学生对科研的研究兴趣，并激励学生不断学习，勇立潮头。