伊犁马MCT1基因多态性与速度性能的关联性分析

吴金秋，张 冲，孟 军,3，曾亚琦,3，加娜尔·努尔顿，王川坤，袁鑫鑫，王彤亮，姚新奎,3

(1.新疆农业大学动物科学学院，乌鲁木齐 830052；2.新疆农业大学马产业研究院，乌鲁木齐 830052；3.新疆马繁育与运动生理重点实验室，乌鲁木齐 830052；4.新疆伊犁哈萨克自治州昭苏马场，新疆昭苏 835000)

0 引 言

【研究意义】运动型伊犁马在国内赛事中提高了国产马的核心竞争力[1]。三磷酸腺苷是肌肉收缩的直接能量来源，高强度体育锻炼需要大量的三磷酸腺苷。通过无氧呼吸可以快速产生能量，将乳酸和氢离子释放到肌肉中。这些离子的积累导致酸中毒和疲劳[2-3]，导致肌肉性能下降[4]。红细胞膜中存在的单羧酸盐转运蛋白同工型1(MCT1，Monocarboxylate transporters1)是将乳酸和氢离子从血浆转运到红细胞的关键。肌肉和血浆之间产生的梯度有助于维持酸/碱平衡并延迟肌肉疲劳。单羧酸盐转运蛋白1T等位基因与红细胞乳酸转运率降低有关[5]。当运动强度超过乳酸盐阈值时，乳酸盐的产生大于其清除，导致肌肉细胞中乳酸盐的积累。马匹的速度性能直接影响着马匹的竞技性能和价值。MCT1基因突变是影响马匹速度性能的遗传因素之一，从分子水平上寻找决定伊犁马速度运动性能的功能基因，根据运动特性的不同而进行精准的选材，能够更好的发挥运动性能的优势，在比赛中获取更好的成绩。基因多态性能够体现马匹运动性能，开展对提高伊犁马早期选育研究具有实践意义。【前人研究进展】运动性能是一种复杂的表型，受到多种环境和遗传因素的影响等[6-7]。MCT1的关键生理学作用是从循环中吸收乳酸，而MCT4似乎更适合于辅助血液循环。MCT1基因可能与精英运动员的表现有关[8]。有20多个核苷酸多态性与运动性能有关[9]。Bickham等[10]对7名中长跑运动员进行了为期6周的短跑训练，训练后MCT1显著增加，MCT4没有增加，MCT1对于成绩具有一定的影响。MCT1与运动员存在一定的关联性。Gurgul等[11]研究表明MCT1基因通过控制阿拉伯马在速度赛中的乳酸代谢与运动适应性之间存在显著关联性。Sawczuk等[12]研究发现MCT1T等位基因与隐性遗传模型中的短跑力量表现相关，并且与两个对照组相比，短跑力量运动员中TT基因型更为普遍，MCT1基因中TT基因型是影响运动成绩的基因型之一。【本研究切入点】目前在伊犁马中基因多态性与速度性能的关联性研究相对较少，影响马匹运动性能的因素包括环境因素和遗传因素。将分子生物学技术应用到伊犁马的选择与培育，能够在一定程度上加快速度马的选育。【拟解决的关键问题】从基因层面分析伊犁马MCT1基因多态性与其速度性能的关联性，筛选出有利于伊犁马比赛速度的分子标记位点，为伊犁马早期选育提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材 料

1.1.1 马 匹

选取2019～2021年新疆中华民族大赛马参加2 000 m速度赛的2岁伊犁马50匹，其中公马和母马各25匹，使用EDTA抗凝真空采血管，左侧颈静脉采血5 mL，-20℃冰箱保存，用于提取伊犁马基因组DNA，利用终点计时器记录伊犁马2 000 m比赛成绩。

1.1.2 试剂及仪器

主要试剂：Taq Hot Start Version(TAKARA公司)；10×Buffer I；Bigdye(ABI公司)；Ezup柱式血液基因组DNA抽提试剂盒(上海生工)；dNTP(2.5 mM)；HSTaq；DNA Mark；1.5%琼脂糖。

主要仪器：台式恒温金属浴，Centrifuge 5415D离心机，NAS-99分光光度计，BC-subMID电泳仪，电泳槽，GeneAmp 9700 PCR仪，3730XL遗传分析仪。

1.2 方 法

1.2.1 运动性能数据

伊犁马在2 000 m比赛时利用终点计时器记录比赛成绩，获取马匹运动性能数据。

1.2.2 引物设计

使用Ezup柱式血液基因组DNA抽提式试剂盒提取伊犁马血液样本基因组DNA。用1%琼脂糖凝胶电泳直接检测DNA质量，使用Nanodrop2000分光光度计对浓度进行检测，-20℃保存备用。

参考Genbank中公布的位于第五号染色体上的纯血马基因序列，以MCT1基因(登录号：NC_009148.3)的第2、3外显子区域及附近区域为检测目标，利用Primer5.0软件设计引物，引物基本信息，引物序列送往天津康普森检测检验有限公司合成。表1

表1 引物信息

1.2.3 PCR扩增及测序

(1)PCR反应体系为20 μL。表2。

(2)列出PCR反应条件，将目的片段送往天津康普森检测检验有限公司测序。表3

1.2.4 生物信息学

使用在线软件SOPMA对错义突变位点不同基因型进行蛋白质二级结构预测，网址为https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.Pl page=npsa_sopma.html

1.3 数据处理

采用直接测序进行序列分析，利用DNAMAN6.0.3.99官方中文版本进行序列比对，利用Chromas2.3官方版本软件查看序列峰图并判定SNP位点，利用在线程序BLAT查找位点信息。

表2 PCR反应体系

利用Excel软件分别计算不同位点在所测群体中的基因型频率、等位基因频率、群体杂合度(He)、有效等位基因数(Ne)、多态性信息含量(PIC)并检验是否符合Hardy-Weinberg平衡定律。采用SPSS26.0软件分析，以MCT1基因不同基因分型为分组依据，对MCT1基因不同的基因型与伊犁马速度性能进行One-Way ANOVA方差分析和LSD(Least Significant Difference)多重比较，结果以平均数±标准差表示。

表3 PCR反应条件

2 结果与分析

2.1 不同伊犁马匹2 000 m比赛速度对比(表4)

表4 伊犁马2 000 m比赛速度

2.2 基因测序

研究表明，在选取伊犁马MCT1基因第2外显子上发现1个突变位点SNP，但是在第3外显子上没有发现SNP，利用DNAMAN、Chromas两者判定SNP位点。

利用BLAT确定SNP位点信息，利用BioXM2.6来判断突变类型，MCT1基因在g.52168582T>G处发生碱基突变，该突变位点使碱基T突变为碱基G，该碱基突变导致第六号位置编码氨基酸由苯丙氨酸(F)变为亮氨酸(L)，故此突变位点为错义突变位点，一共包含3种基因型，即TG、TT、GG。图1

图1 伊犁马 MCT1基因第2外显子SNP位点测序及基因分型

2.3 伊犁马MCT1基因的群体遗传学结构多样性

研究表明，根据EXCELE表格计算伊犁马MCT1基因第2外显子SNP突变位点群体遗传信息。其中，TT基因型频率为52%、TG基因型频率为40%、GG基因型频率为8%；T等位基因频率72为%、G等位基因频率为28%；所以在SNP中TT为优势基因型，T为优势等位基因。MCT1基因SNP突变位点多态信息含量(PIC)为0.287，根据多态信息含量分类，故SNP突变位点为中度多态位点(0.250.05)。

2.4 伊犁马MCT1不同基因型与速度性能的关联性

研究表明，利用SPSS26.0软件对MCT1基因SNP突变位点不同基因型间伊犁马速度性状进行方差分析。结果显示伊犁马在2 000 m速度赛中MCT1基因该突变位点不同基因型平均速度均有所差异，即GG基因型为11.03 m/s左右，TG基因型为11.72 m/s左右，TT基因型为12.1 m/s左右。伊犁马在2 000 m速度赛中，TT基因型个体的平均速度快于GG和TG基因型个体平均速度，且TT基因型个体的平均速度显著快于GG基因型个体的平均速度(P<0.05)，但与TG基因型个体的平均速度显示差异不显著(P>0.05)；TG基因型个体平均速度快于GG基因型平均速度，但他们之间显示差异不显著(P>0.05)，总体2 000 m平均比赛速度：TT型>TG型>GG型。

2.5 不同基因型所编码MCT1蛋白质的二级结构预测

研究表明，在g.52168582处，T>G为错义突变，由于氨基酸的变化使MCT1蛋白质的二级结够发生了改变。β折叠由10.48%变为10.79%；α螺旋由27.54%变为28.57%；无规卷曲度由28.25变为27.30；伸展度由33.73%变为33.33%。表5，图2

表5 突变前后蛋白质二级结构预测

图2 突变前(a)与突变后(b)蛋白质二级结构

3 讨 论

3.1 MCT1基因群体遗传多样性

MCT家族目前共有14个成员，其中只有4个成员(MCT1-MCT4)有实验证明能够催化乳酸、丙酮酸和酮体等代谢物上重要的单羧酸盐的质子转运[13]。MCT1在许多组织中表达，包括肌肉和心脏[14-15]。其主要生理作用是根据细胞的代谢状态促进其进入或流出细胞。在肝实质细胞和肾的近曲小管细胞中，MCT1可用于将L-乳酸转运到糖异生细胞中，它是糖异生的主要底物，尤其是在运动后[13]。

马匹MCT1基因定位于第5号染色体上，全长39 463 bp，一共包含外显子6个，内含子4个。本研究通过PCR并且利用DNA直接测序法以MCT1基因第2外显子区域及其附近区域为检测目标进行序列分析，结果在伊犁马MCT1基因第2外显子上检测到1个多态位点，此突变位点在g.52168582处由碱基T突变为碱基G，此突变位点为错义突变位点，一共包含3种基因型，即TT、TG、GG，其中TT为优势基因型，T为优势等位基因，碱基的突变使得氨基酸在6号由苯丙氨酸变为亮氨酸，导致氨基酸的序列发生改变。根据群体内基因型频率和等位基因频率计算PIC值，若PIC值高于0.5则为高度多态位点，若PIC值高于0.25且低于0.5则为中度多态，若PIC值低于0.25则为低度多态，多态信息的高低则由其表示。群体内遗传变异大小是通过有效等位基因数来表达，其反应了等位基因在群体内的分布程度，杂合度也是群体遗传变异的参考数[16-17]。伊犁马MCT1基因PIC值高于0.25且低于0.5为中度多态位点，杂合度高，因此可知伊犁马群体内MCT1基因变异程度较大，遗传多样性较大，因此具有遗传选择的潜力。今后在选育过程中可有目的进行选种育种，加快培育本品种。研究表明伊犁马MCT1基因第2外显子上存在多态位点，可在今后选择育种的过程中进一步利用。

3.2 伊犁马MCT1基因多态性与2 000 m比赛速度关联性

MCT1基因编码一种蛋白质，该蛋白质在比赛中有助于调节肌肉细胞中厌氧糖酵解产生的乳酸。尽管无氧糖酵解是产生剧烈运动和短期运动所需的ATP的最快途径，但它也会导致乳酸在肌肉细胞中的积累，进而导致肌肉疲劳并导致长距离运动的表现降低[8,18-19]。MCT1蛋白通过将乳酸带入骨骼肌细胞(用作呼吸燃料)来帮助维持体内稳态，甚至在更长的距离内也可确保有效的代谢[13,20]。在大鼠和人类中，MCT1在慢性运动和耐力或剧烈性运动训练中表达增加，MCT1基因对运动性能存在一定的影响。由于MCT1基因在马的新陈代谢中起关键作用，MCT1基因家族的变体以前也被认为对耐力赛性能很重要[21-22]。

Sawczuk等[12]通过比较耐力运动员和短跑或力量运动员MCT1基因型分布和等位基因频率，发现TT基因型与短跑或力量型运动员状态有关，这与试验中MCT1TT基因型个体速度快于其它2个基因型个体速度相同，说明此基因型不管是对人类还是马匹都具有一定的影响力。还有学者研究了健康速步马和患有肌病的马MCT1基因中的Lys457GlnSNP，在对照组中的一匹马中发现了AY457175.1：c1573A>C这种多态性，但未观察到与乳酸在红细胞中的运输相关[23]。但是，Mykkänen等[24]在速步马和芬兰马的肌病中研究了相同的基因型，但并未发现与疾病的关联，证实了此基因型可能与马匹疾病并无相关性。Koho等[25]分析了速步马，芬兰马，温血马和冰岛马的相同的多态性位点。Regatieri等[21]通过研究不同品种马匹MCT1在c1573A>C处多态性基因型的分布情况发现，AC基因型只有三匹马存在突变杂合型AC，因此能确定等位基因对所研究的马品种的运动表现的影响。在今后研究中可以扩大测序范围、加大样本量并且加以验证不同基因型对速度性能的影响。在254匹平地赛阿拉伯马中，使用PCR-RFLP或PCR-HRM方法对SNP进行了鉴定和基因分型，结果发现在研究群体中，短距离比赛仅由TT基因型马匹获得名次[18]，与试验伊犁马MCT1基因中TT基因型的伊犁马在2 000 m比赛中速度最快的结果一致，说明了MCT1基因中TT基因型可能对马匹速度性能产生一定的影响。不同基因型的个体适于不同距离的比赛，这表明有可能使用MCT1基因中的SNP作为标记来预测一匹马最佳比赛距离[26]，为进一步研究以验证MCT1基因作为与比赛性能相关的潜在标志物的使用提供了基础，并且也通过基因分型共发现3种基因型即TT、GG、TG，其中TT基因型个体的平均速度显著快于GG基因型个体平均的速度，与此得出相同的结果。

4 结 论

伊犁马MCT1基因第2外显子共检测到一个突变位点，该突变位点属于中度多态位点，并且处于Hardy-Weinberg平衡状态；存在3种基因型，在g.52168582T>G处为错义突变，导致其编码的氨基酸由苯丙氨酸变为亮氨酸，使得编码MCT1蛋白质的二级结构发生改变，影响马匹运动性能，该突变位点可能是影响马匹速度性能的重要位点，伊犁马早期选育过程中可以有目的针对该位点进行选育。

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