胶东地区不同家禽弯曲菌流行分布及耐药特征分析

王 娟,黄秀梅,刘俊辉,李 彦,刘 娜,赵建梅,段笑笑,高玉斌,王 琳,赵 格,曲志娜,王君玮

弯曲菌属(Campylobacter)有15个种,其中的空肠弯曲菌和结肠弯曲菌是引起人类疾病的主要病原菌[1],可引起人急性胃肠炎和食物中毒,甚者发生瑞特氏病或吉兰-巴雷综合征等免疫性损伤性疾病;可引起动物的流产不孕、乳房炎及幼畜禽腹泻以及家禽肝炎等[2]。空肠弯曲菌和结肠弯曲菌广泛存在于家禽、家畜等动物体内,尤其是家禽及其产品成为弯曲菌向人类传播的主要媒介,该菌也是国际公共卫生关注的重点[3]。虽然弯曲菌在家禽致病方面的研究不多,但该菌在多数禽类肠道内存在定殖,尽管不一定引起家禽发病,但据欧洲安全局研究证实人类80%弯曲菌感染是由禽类传播导致的[4]。目前,随着耐药菌株的蔓延和多重耐药菌株的不断出现,人兽共患病原菌的流行特征和耐药程度备受社会关注。

多位点序列分型(multilocus sequence typing, MLST)是通过对细菌的7个管家基因测序获得等位基因序列,经比对分别获得相应的等位基因值,从而构成每株菌的等位基因谱,从而得到相应的序列型(Sequence type, ST)[5-6]。在MLST数据库,每株菌株都有相对应的唯一ST型别,以用语国际化分离菌株的信息比对与分析。

本研究对胶东地区不同家禽分离的131株禽源弯曲菌进行了MLST分型,同时测定了MIC值,初步分析了胶东地区不同禽源弯曲菌的流行分布特征,以及耐药性差异。以期为掌握禽源弯曲菌在该地区的潜在风险,预防该菌由家禽向人和产品传播提供数据支持。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 标准菌株空肠弯曲菌 标准菌株(ATCC33560)、结肠弯曲菌标准菌株(ATCC33559)均购自国家菌种保藏中心。

1.1.3 主要仪器设备 生物安全柜、恒温培养箱、全自动微生物质谱检测系统(Autofms 1000)、电热恒温水浴锅、旋涡混合仪、PCR仪、电子天平、凝胶成像系统。

1.1.4 样品来源 2021年8月至10月期间,在胶东地区从37个家禽养殖场:蛋鸡场14个、肉鸡场13个、水禽场(肉鸭、鹅)10个,采集泄殖腔样品共565份,用于本研究。

1.2 方法

1.2.1 细菌分离与鉴定

1.2.1.1 细菌分离与纯化 将采集的拭子样品放入分装好含5%绵羊血的Bolton肉汤中,42 ℃微需氧条件下增殖24 h后,用接种环取增菌液划线接种Skirrow血琼脂培养基,42 ℃微需氧培养48 h后;选择透明、扁平、湿润的菌落,接种于哥伦比血平板上进行纯化培养,同时涂片、染色、镜检。

1.2.1.2 细菌鉴定 挑取氧化酶试验阳性、过氧化氢酶试验阳性、马尿酸盐水解试验阳性的新鲜单个菌落涂布于96孔靶板上,使用MS1000全自动微生物质谱检测系统进行鉴定,同时接种ATCC33560、ATCC33559做阳性对照。

1.2.2 耐药性检测 根据养殖场菌株分离情况及每个养殖场不超过5株菌的原则,共选取67株空肠弯曲菌和64株结肠弯曲菌代表菌株,采用美国临床实验室标准化委员会(CLSI)推荐的的肉汤稀释法测定,使用96孔药敏板测定6类9种抗菌药得最小抑菌浓度(Minimal inhibitory concentration, MIC),并根据CLSI的判定标准获得实验菌株敏感(S)、中介(I)、和耐药(R)的结果,同时质控菌株ATCC33560同步进行实验质量控制,质控菌株的MIC在质控范围内,且阳性对照和阴性对照都成立,则结果判读有效。对3类及3类以上抗菌药同时耐药即为多重耐药。

1.2.3 菌株MLST分型 参照MLST数据库(http://www.mlst.net/databases/)推荐的方法,对131株获得药敏试验结果菌株,分别选取空肠弯曲菌和结肠弯曲菌MLST分型相关的7个管家基因(空肠弯曲菌管家基因:aspA、glnA、glyA、gltA、tkt、pgm、uncA;结肠弯曲菌管家基因:asp、gln、hlt、hly、pgm、tkt、unc)扩增和测序引物进行MLST实验[6]。25 μL反应体系:12.5 μL Premix Ex Taq、上下游引物(10 μmol/L)各1 μL、模板DNA 1 μL、无菌去离子水10.5 μL。PCR反应条件:94 ℃预变性3 min;94 ℃变性2 min,50 ℃退火1 min,72 ℃延伸1 min,35个循环。PCR产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳验证,将片段大小与预期一致、条带清晰明亮且单一的样品送至上海生工生物工程有限公司测序。用BN软件对测序返回数据进行处理,获得各菌株所对应的等位基因谱,确定其序列型,并构建其最小生成树,分析不同区域的流行菌株型。

1.2.4 数据统计及处理 使用SPSS 26.0软件、卡方检验进行统计分析,P<0.01,则差异有统计学意义。利用BioNumerics7.6软件构建了基于MLST性别的最小生成树。在最小生成树种,一个圈代表一个MLST型,圈的大小代表菌株数量的多少,圆圈之间的距离代表禽源关系远近。

2 结 果

2.1 分离鉴定结果 经质谱鉴定,565份泄殖腔样品中共得到弯曲菌237株(详见表1),总体分离率为41.95%,其中空肠弯曲菌127株,结肠弯曲菌110株,分离率分别为22.48%、19.47%。从不同家禽看,蛋鸡源弯曲菌分离率最高(52.73%),其次是水禽(37.33%)、肉鸡(33.33%);蛋鸡源空肠弯曲菌分离率最高(33.18%),水禽源结肠弯曲菌分离率最高(21.33%)。且该地区3种不同来源菌株分离率差异均有统计学意义,详见表2。

表1 胶东3种禽源采样点样品及菌株分布

表2 胶东地区不同家禽弯曲菌分离率(菌株数/样品数)

2.2 药敏实验结果

2.2.1 耐药结果 根据CLSI的判定标准,67株空肠弯曲菌和64株结肠弯曲菌对9种药物的耐药情况见表2。胶东地区分离的空肠弯曲菌和结肠弯曲菌对9种药物均有不同程度的耐药。67株空肠弯曲菌对环丙沙星、萘啶酸、四环素的耐药十分严重,耐药率均为92.54%以上,对庆大霉素、克林霉素、红霉素、阿奇霉素、泰利霉素、氟苯尼考敏感,耐药率均在15%以下;64株结肠弯曲菌对环丙沙星、萘啶酸100%耐药,对四环素耐药率为96.88%,对庆大霉素耐药率为85.94%,对克林霉素、红霉素、阿奇霉素、泰利霉素为中等程度耐药,耐药率在51.56%～60.94%,对氟苯尼考最敏感,敏感率为71.87%。详见图1。

图1 胶东地区禽源空肠弯曲菌与结肠弯曲菌耐药率比较)

从不同家禽看,水禽源空肠弯曲菌和结肠弯曲菌对9种药物大耐药情况较肉鸡和蛋鸡源菌株都严重。蛋鸡源空肠弯曲菌对环丙沙星、萘啶酸、四环素耐药率均在91%以上,对庆大霉素耐药率为14.29%,对其余4种药物均不耐药;肉鸡和水禽源结肠弯曲菌对环丙沙星、萘啶酸、四环素3种药物均耐药。详见表3。

表3 67株空肠弯曲菌与64株结肠弯曲菌对9种药物的耐药结果

2.2.2 多重耐药结果 131株弯曲菌多重耐药率为49.62%(65/131)。按大类分,11株空肠弯曲菌多重耐药,占比为16.42%(11/67),3耐最多,未发现全耐空肠弯曲菌;54株结肠弯曲菌为多重耐药,占比为84.38%(54/64),且5耐、6耐最多,占多耐菌株的72.22%(39/54)。多重耐药结果见图2、耐药谱见表4。

图2 胶东地区三种家禽源空肠弯曲菌与结肠弯曲菌多重耐药结果)

从不同家禽看,空肠弯曲菌中,蛋鸡无3耐以上菌株,肉鸡、蛋鸡、水禽3种禽源菌株多重耐药率分别为10.53%(2/19)、11.43%(4/35)、38.46%(5/13);结肠弯曲菌中,3种禽源菌株均无0耐、1耐和4耐菌株,肉鸡除1株2耐菌株外,其余菌株均为多重耐药,且6耐菌株最多,占菌株数的47.62%(10/21),肉鸡、蛋鸡、水禽3种禽源菌株多重耐药率分别为95.24%(20/21)、76%(19/25)、83.33%(15/18)。

2.3 弯曲菌MLST分型结果 67株空肠弯曲菌和64株结肠弯曲菌各自的7个管家基因扩增产物测序结果与MLST网络数据库中的菌株序列(www.mlst.net)BLAST比对分析可知(详见表4):67株空肠弯曲菌共得到72个等位基因,包括3个新的等位基因,得到35个序列型。包括6个新的序列型,分布较分散,不同禽源菌株均无优势ST型,其中ST-8880、ST-1811、ST-8260、ST-760相对较多,各占菌株5.97%(4/67),说明该菌不同禽源间有较高的遗传多样性;64株结肠弯曲菌共得到27个等位基因,同源复合体CC-828最多,占59.38%(38/64),其中ST-1586序列型最多,占总数的23.44 %(15/64),其次是ST-825,占总数的17.19%。从菌株不同来源看,肉鸡源结肠弯曲菌主要以ST-1586、ST-9944、ST-3735为主,约占菌株数的80.95%(17/21);水禽以ST-825、ST-1586居多,占72.22%(13/18)。对不同禽源分离菌株建立了基于MLST型别的最小生成树,展示了不同禽源菌株的种群结构及菌株间亲缘关系,详见图3和图4。

图3 空肠弯曲菌基于不同禽源MLST最小生成树)

(注:EC:蛋鸡;BC:肉鸡; WF:水禽)

3 讨 论

弯曲菌中的空肠弯曲菌和结肠弯曲菌是重要的食源性致病菌。近年来,抗生素的不规范使用导致动物源弯曲菌的耐药性日趋严重,耐药菌株在“同一健康”下“动物-环境-人”之间传播的对人类健康带来影响。本研究通过监测胶东地区分离的131株禽源弯曲菌对9种常用抗菌药物的耐药结果发现,弯曲菌对环丙沙星、萘啶酸、四环素显示出高水平耐药,耐药率在94%以上;尤其是结肠弯曲菌,除2株菌外,其余分离菌株均对这3种药物耐药;结肠弯曲菌对测试的9种药物耐药率均显著高于空肠弯曲菌。不同家禽分离菌株耐药程度差异较大,水禽源菌株对除四环素外的其余药物敏感率均低于蛋鸡和肉鸡源菌株;蛋鸡源空肠弯曲菌对克林霉素、红霉素、阿奇霉素、泰利霉素、氟苯尼考无耐药菌株。所以,在临床药物选择上,对不同家禽应注意规避对应高耐药物的使用。有报道显示,鸡源空肠弯曲菌和结肠弯曲菌对环丙沙星耐药程度较高,耐药率80%以上[7],甚至达到100%[8]。本研究中结肠弯曲菌对克林霉素、红霉素、泰利霉素耐药程度与于辉等[9]报道的50%～70%一致。胶东地区禽源结肠弯曲菌对庆大霉素的耐药率与聂和敏等[10]报道的69.70%、张小燕等[7]报道的71.25%和唐梦君等[11]报道的71.00%相差不大,但较于辉等[8]报道的28.57%高54.76%。结肠弯曲菌多重耐药情况严重,稍低于胡欣洁等[12]报道的94.5%,且出现对9种药物全部耐药菌株,说明存在常规药物对人感染禽源结肠弯曲菌治疗无效的风险,这与王新等[13]人的研究结果一致。根据监测结果发现的问题,有必要对喹诺酮类、四环素、氨基糖苷类抗生素在家禽养殖过程中的应用进行评价,从而指导家禽养殖企业对抗生素的合理使用,以避免抗生素的过度和重复使用,有效遏制耐药菌株的产生和流行,从而保障人类健康。

MLST作为一种常用的分子分型方法,具有分辨率高、重复性强、数据可靠性、结果便于不同实验室进行比较等优点,被用于多种细菌的分型和溯源[14-15]。本研究针对胶东地区不同家禽分离的67株空肠弯曲菌和64株结肠弯曲菌进行了MLST分型,分别获得了35种和19种不同的序列型,其中,8株分离菌株属于6种新序列型,新序列型占比为10.91%,发现的新序列型数量占比与王新[13]从禽肉分离的菌株,及薛峰[16]、姚学萍[17]从家禽盲肠和肠道内容物分离的菌株新序列型所占比例均有差异,这可能与不同地区分离菌株的遗传进化有关[16-18]。本研究结果显示,空肠弯曲菌ST型散在分布于各个同源复合体,该地区及不同禽源间均无优势ST型,与秦祥等[19]的研究一致,说明禽源空肠弯曲菌不是以单一克隆株的形式在该地区家禽养殖场水平传播,并呈丰富多样的遗传进化;而一半以上的结肠弯曲菌ST型为同源复合体CC-828,ST-1586序列型为流行菌型,在肉鸡场和水禽场内的水平传播及遗传进化分别以ST-1586和ST-825型为主。但是,本研究得到1株肉鸡源空肠弯曲菌为ST-51(CC-443),该ST型的空肠弯曲菌与人类神经系统疾病(GBS)有关[19],意味着携带该菌的动物群对人类来说会是一个巨大的潜在隐患。

弯曲菌在胶东地区家禽中分布广泛,且不同家禽中空肠弯曲菌和结肠弯曲菌的携带情况略有差异;不同禽源弯曲菌耐药程度有一定差异,结肠弯曲较空肠弯曲菌耐药程度严重,且均为多重耐药菌株;该地区空肠弯曲菌ST型散在分布且丰富多样,结肠弯曲菌ST型相对集中,且菌株耐药程度与ST型相关性不大。综上所述,结肠弯曲菌对药物更容易产生耐受,空肠弯曲菌在环境中容易发生变异,且存在导致人类严重疾病的空肠弯曲菌型,应加强家禽养殖过程中弯曲菌的动态监测,以便提高家禽产品质量安全,降低从业人员感染风险,保护人类健康安全。

利益冲突：无