基于Sirt1 通路探讨栝楼桂枝汤对缺血性卒中后神经元损伤的保护作用

杨劲博 钟兴华 林心君 胡海霞 朱晓勤

脑卒中中医名为中风,是一种常见的脑血管疾病,分为缺血性卒中和出血性卒中,缺血性卒中占80%,严重危害患者的健康和生命［1］,缺血性卒中涉及到血脑屏障功能障碍、炎症反应、氧化应激等多种机制,最终导致不可逆的脑组织损伤［2,3］,同时肢体痉挛［4］是最主要的后遗症。脑缺血后机体内产生的氧化应激是导致脑组织损伤的主要因素。氧化应激是自由基生成过多与抗氧化机制消除之间的一种不平衡状态［5,6］。缺血再灌注发生后,神经系统中活性氧(ROS)生成过多,通过蛋白质、脂质和DNA 的氧化修饰［7,8］,破坏血脑屏障的完整性,激活炎症细胞和促进白细胞浸润来增强炎症反应,导致自噬、凋亡引起卒中后继发性脑损伤［9,10］。GLGZD 源于《金匮要略》,功效为解肌祛邪,舒缓筋脉,主治太阳柔痉体强证,用于治疗脑卒中后肢体痉挛［11］,在基础研究和临床研究中均表现出对脑卒中的保护作用［12,13］,本研究基于中药多靶点调控卒中后的氧化还原稳态,探讨GLGZD 通过Sirt1/PGC-1α/ERRα 通路抑制凋亡进而减轻神经元损伤的作用机制,为临床用药提供基础实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 SPF 级健康雄性SD 大鼠60 只,体质量(180±20)g,购自上海斯莱克实验动物责任有限公司,生产许可证号：SCXK(泸)2017-0005,饲养于福建中医药大学实验动物中心,使用许可证号：SYXK(闽)2019-0007。本研究已通过福建中医药大学动物伦理委员会审核,并严格遵循动物伦理相关规定。

1.1.2 药物 GLGZD 组方：栝楼根30 g、桂枝9 g、生姜9 g、白芍9 g、大枣9 g、甘草6 g。均购自福建中医药大学第三附属医院国医堂。上述药材煎煮2 次并浓缩至1.06 g/ml。灌胃时根据人与大鼠临床等效剂量换算。

1.1.3 试剂 GAPDH 抗体(Bioss 公司,货号：bsm-0978M)；Sirt1 抗体(SantaCruz 公司,货号：sc-74465)；PGC-1α 抗体(abcam 公司,货号：ab191838)；ERRα抗体(CST 公司,货号：#13826)。

1.1.4 仪器 光学显微镜、倒置荧光显微镜(德国Leica 公司,型号分别为：DM400B LED、DMi8)。

1.2 方法

1.2.1 大脑中动脉阻塞模型制备 戊巴比妥钠(2%)腹腔注射麻醉大鼠并固定于鼠板上,于颈正中剪一切口,分离颈总动脉、颈内动脉以及颈外动脉,结扎颈总动脉、颈外动脉,用眼科剪在颈总动脉近心端血管壁剪一小口,将线栓从颈总动脉插入颈内动脉,线栓进入的深度约为18 mm,阻断血流供应1.5 h,后将线栓部分退出,恢复血流供应。待大鼠从麻醉中苏醒,参照改良神经功能缺损Longa 评分对大鼠神经功能损伤程度进行评价,评分为1～3 分者视为造模成功,纳入实验。

1.2.2 分组与给药 将造模成功的40 只大鼠随机分为MCAO 组与GLGZD 组,每组20 只；另外20 只设Sham 组,仅钝性分离肌肉血管,不插入线栓。三组大鼠均在手术当天评分并于分组后开始灌胃干预,Sham组和MCAO 组给予0.9%生理盐水灌胃,GLGZD 组给予GLGZD 水提液灌胃,1 次/d,连续7 d。

1.2.3 Longa 评分评估神经功能缺损 分别于造模结束后及药物干预7 d 后,采用Longa 评分进行神经行为学评定［14］。

1.2.4 模型大鼠血清中MDA、GSH-Px 的含量测定取大鼠血清,按照MDA 测试盒说明书和GSH-Px 测试盒说明书,检测各组大鼠血清中MAD、GSH-Px 含量。

1.2.5 qPCR 法检测Sirt1、PGC-1α、ERRα mRNA的表达水平 Trizol 法提取大鼠脑组织总mRNA,参照试剂盒方法逆转录和qPCR 反应。引物序列见表1。以GAPDH 作为内参,使用2-ΔΔCt计算目标mRNA 的相对表达量。

表1 引物序列

1.2.6 Western blot 法检测Sirt1、PGC-1α、ERRα蛋白的表达水平 取脑组织称重并置于研磨仪,裂解后,进行BCA 蛋白定量、金属水浴变性,-20℃保存。通过SDS-PAGE 凝胶电泳及转模,以GAPDH 为内参,对Sirt1(1∶500,132 kDa)、PGC-1α(1∶1000,91 kDa)、ERRα(1∶1000,50 kDa)、GAPDH(1∶5000,36 kDa)蛋白进行半定量分析。

1.2.7 TUNEL 法检测缺血侧脑组织神经细胞的凋亡率 石蜡切片脱蜡复水固定后,滴加蛋白酶K 室温孵育30 min,平衡缓冲液室温孵育10 min,滴加50 μl rTdT缓冲液,37℃避光孵育1 h,滴加2 × SSC 溶液避光孵育15 min,DAPI 染核8 min,抗荧光淬灭封片剂封片,于荧光倒置显微镜200 倍镜下观察。

1.3 统计学方法 采用SPSS22.0 统计学软件处理数据。计量资料以均数±标准差()表示,符合正态分布的数据采用单因素方差分析,方差齐性的数据采用最小显著差法检验,方差不齐的数据则采用盖姆斯-霍威尔法。不符合正态分布的数据采用非参数检验。P＜0.05 表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 GLGZD 对模型大鼠Longa 评分的影响 干预后,MCAO 组与GLGZD 组Longa 评分均高于Sham 组,差异有统计学意义(P＜0.01)；GLGZD 组Longa 评分低于MCAO 组,差异有统计学意义(P＜0.01)。见图A。

图A 大鼠Longa 评分

2.2 GLGZD 对模型MDA、GSH-Px 含量的影响 干预后,MCAO 组MDA 水平高于Sham 组、GSH-Px 水平低于Sham 组,差异均有统计学意义(P＜0.05)；GLGZD组MDA 水平低于MCAO 组、GSH-Px 水平高于MCAO组,差异有统计学意义(P＜0.05)。见图B。

图B 大鼠血清MDA、GSH-Px 的表达

2.3 GLGZD 对模型大鼠缺血侧脑组织Sirt1、PGC-1a、ERRa 的mRNA 和蛋白表达水平的影响 qPCR与Western blot 实验结果显示,干预后,MCAO 组Sirt1、PGC-1α、ERRα 的mRNA 及蛋白表达水平低于Sham 组,差异有统计学意义(P＜0.05)；GLGZD 组Sirt1、PGC-1α、ERRα 的mRNA 及蛋白表达水平均高于MCAO 组,ERRα 的mRNA 及蛋白表达水平低于Sham 组,差异有统计学意义(P＜0.05)；见图C。

图C 大鼠Sirt1/PGC-1α/ERRα 通路基因和蛋白的表达

2.4 GLGZD 对模型大鼠缺血侧脑组织神经细胞凋亡率的影响 TUNEL 染色显示,干预后,Sham 组大鼠少见TUNEL 阳性细胞,神经细胞凋亡较少；MCAO 组大鼠缺血侧脑组织神经细胞凋亡率高于Sham 组,差异有统计学意义(P＜0.05)；GLGZD 组缺血侧脑组织神经细胞凋亡率低于MCAO 组,差异有统计学意义(P＜0.05)。见图D。

图D 大鼠神经细胞凋亡率(TUNEL 染色200×)

3 讨论

缺血性卒中是一种具有复杂特性的脑部疾病,涉及到多种病理生理过程。MCAO 模型是目前国际上认可和通用的缺血性卒中模型。本研究发现,经GLGZD干预后,卒中后神经功能缺损明显减轻。

氧化应激是导致缺血性脑卒中后神经功能损伤的重要病理环节。MDA 是氧化应激的标志物之一,最能反映组织氧化损伤的程度。GSH-Px 参与清除过多的ROS,在保护细胞免受氧化损伤中起着关键作用。降低MDA 含量、增加GSH-Px 活化,有利于减轻氧化应激损伤,起到神经保护作用［15,16］。本实验结果显示,GLGZD 干预后,MDA 含量明显减少,GSH-Px 含量明显升高,说明GLGZD 通过减轻氧化应激损伤起到保护作用。

Sirtuins(Sirts1-7)［17］是烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)依赖的组蛋白脱乙酰酶家族,主要通过蛋白质的去乙酰化、多聚磷酸核糖基化等机制参与蛋白质的翻译后修饰［18］。Sirt1 与过氧化物酶体增殖物激活受体(PPAR)γ 辅活化因子-1α(PGC-1α)相互作用［19］并直接去乙酰化,提高其转录活性,去乙酰化PGC-1α更有效地招募ERRα 等转录因子［20］,减轻ROS 生成所致的代谢障碍,减少氧化损伤维持细胞稳态,保护神经元免受凋亡。本实验结果显示,MCAO 组Sirt1、PGC-1α、ERRα 表达水平较Sham 组显著降低,GLGZD 干预后,上述情况出现逆转,提示GLGZD 可通过调控Sirt1/PGC-1α/ERRα 通路起到神经保护作用。

氧化应激通过多种途径诱导细胞凋亡。DNA 片段化是凋亡标志之一。通过TUNEL 检测DNA 片段化,简单、快速地检测大鼠脑组织中的凋亡细胞。本研究发现GLGZD 干预后,可显著减少大鼠缺血侧TUNEL 阳性细胞比例,降低神经细胞凋亡率,发挥神经保护作用。

综上所述,GLGZD 可显著改善大鼠神经功能缺损,通过调控Sirt1/PGC-1a/ERRa 通路降低氧化应激损伤,减轻神经元凋亡,对脑缺血再灌注损伤具有较好的保护作用,这也为本实验进一步研究GLGZD 的作用机制提供了实验依据。本实验不足之处在于,仅探讨Sirt1/PGC-1a/ERRa 通路对氧化应激的调控作用,其复杂的调控过程与关系有待进一步探索,故药物多通路的调控作用可作为未来深入研究的重点方向。