菊花ANS基因的鉴定及与其他药用植物的生物信息学分析

李东润，刘 奥，许清烽，张宇婷

(辽宁何氏医学院，沈阳 110000)

菊花在我国有悠久的用药历史，是药食同源的中药，来源于菊科植物菊(ChrysanthemummorifoliumRamat.)的干燥头状花序，具有平肝明目、清热解毒等功效，常用于治疗风热感冒、眼目昏花、目赤肿痛等症状[1-2]。菊花品种繁多，成分复杂，化学成分受到生长环境、产地、种质资源、采收期等因素的影响。

花青素(anthocyanins)是植物次生代谢中产生的黄酮类化合物，可使果实和花等产生特定的颜色。其中，花青素合成酶(ANS)位于花青素合成途径的下游区段，是催化无色花色素转变成为有色花色素的关键酶之一[3]。研究表明，花青素具有抗菌消炎、抗氧化、抗衰老等作用[4]。

利用生物信息学方法，对菊花ANS的理化性质、亚细胞定位、信号肽、蛋白质空间结构等进行分析，为菊花ANS基因的功能研究奠定基础。对拟南芥(Arabidopsisthaliana)、红花(Carthamustinctorius)、辛夷(Magnoliasprengeri)、玫瑰(RosarugosaThunb)、白桑(Morusalbavar.multicaulis)、茶(Camelliasinensis)等不同药用植物的LDOX/ANS基因的核苷酸及氨基酸序列的组成、生化特性、结构特点等进行推测和分析，构建系统进化树，以期明确该酶的结构和功能。

1 材料与方法

1.1 材料

菊花花青素合成酶ANS序列来源于Genbank美国国立生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information，NCBI)。

1.2 方法

ORF Finder在线工具查找ANS基因序列，ExPASy ProtParam工具分析ANS蛋白的理化性质(https://web.expasy.org/protparam/)，使用ExPASy ProtScale工具分析ANS的亲/疏水性，利用SignalP-5.0工具在线预测ANS的信号肽，确认其是否为跨膜蛋白。利用PSORT工具预测ANS蛋白的亚细胞定位。用Predict protein和SWISS-MODEL工具分析二级结构和三级结构。利用MEGA-X软件构建系统进化树。

2 结果与分析

2.1 ANS序列分析

在NCBI数据库中下载ANS基因序列，下载基因全长为1 238 bp，经blastp匹配，含有1个完整的开放阅读框序列，长度为1 062 bp，起始于第78 bp，终止于第1 139 bp，氨基酸为353个。

图1 菊花BLAST匹配Fig.1 Chrysanthemum BLAST matching

2.2 ANS蛋白理化性质分析

ANS蛋白分子质量为 39.59 kD，分子式为 C1811H2855N477O535S11，理论等电点是5.73，脂肪系数为90.87，平均疏水性为-0.409，表明ANS蛋白是亲水性蛋白。半衰期为30 h，不稳定指数为41.45，属于稳定蛋白。ANS蛋白氨基酸组成中，亮氨酸含量最高，占总氨基酸数的10.1%；脯氨酸和色氨酸含量最低，占总氨基酸数的1.4%。其中，负电荷氨基酸残基总数为(Asp + Glu)51个，正电荷氨基酸残基总数为(Arg + Lys)42个。详见表1。

表1 不同植物LDOX/ANS基因及对应氨基酸序列的组成成分及理化性质Tab.1 Composition and physicochemical properties of LDOX/ANS genes and corresponding amino acid sequences in different plants

2.3 ANS蛋白信号肽预测分析

采用SignalP 5.0 Server在线软件，分析预测8种不同来源ANS的信号肽。结果显示，所有ANS均不含信号肽，说明ANS属于非分泌性蛋白。亚细胞定位应用Cell PLoc server在线工具，分析得到菊花和百合位于细胞质，其他位于叶绿体。上述所有蛋白均没有跨膜结构域，信号肽预测结果与跨膜结构域分析结果一致。

图2 菊花信号肽预测Fig.2 Chrysanthemum signal peptide prediction

2.4 ANS二级及三级结构分析

通过SOPMA分析工具，预测菊花ANS氨基酸序列的二级结构，结果详见表2，其中，菊花ANS蛋白质二级结构的主要结构元件是ɑ-螺旋、无规则卷曲、β-折叠、延伸链。对拟南芥及其他物种的氨基酸序列的二级结构进行预测，结果相似，说明菊花ANS与实验中的大多数植物ANS蛋白一样，具有稳定的青花素合成酶结构，进一步推断菊花ANS基因可能在青花素代谢途径中具有重要的作用。利用SWISS-MODEL在线工具，对ANS的三级结构进行预测，发现其三级结构组成与二级结构一致。

表2 ANS蛋白的二级结构主要构成组件比例Tab.2 Main constitutes proportions of the secondary structure of ANS proteins

图3 菊花二级结构分析Fig.3 Chrysanthemum secondary structural analysis

图4 菊花开放阅读框(ORF)分析Fig.4 Analysis of Chrysanthemum Open Reading Frame (ORF)

2.5 比对分析ANS核苷酸序列及构建系统进化树

用MEGA-X软件对拟南芥、菊花、红花、辛夷、玫瑰、百合、白桑、茶、岩藻在实验中选定的9种植物的核苷酸序列做物种核苷酸序列，进行多序列比对分析，采用邻接法(Neighbor-Joining Tree，NJ)、最大似然法(Maximum-Likelihood Tree，ML)、最小进化法(Minimum-Evolution，ME)，分别进行系统进化树的构建。结果表明，3种系统进化分析方法所得的结果较一致，其中，菊科红花和菊科菊花的3种统计结果高度一致，在进化上分支上，得到的结果都是分为一支，这一结果与传统形态分类的归属一致，另外，采用NJ法和ML法显示，在进化上与十字花科的拟南芥进化距离更近，估计该基因在作用机制上也更加接近。

图5 不同物种ANS基因基于邻接法的系统进化分析Fig.5 Phylogenetic analysis of ANS genes in different species based on neighbor-joining method

图6 不同物种ANS基因基于ML系统进化分析Fig.6 Phylogenetic analysis of ANS genes in different species based on ML

图7 不同物种ANS基因基于ME系统进化分析Fig.7 Phylogenetic analysis of ANS genes in different species based on ME

3 结论与讨论

ANS作为花青素合成后期的关键酶一直受到了广泛关注[5]。在花青素生物合成中，ANS 基因发挥着重要的作用，主要通过2-酮戊二酸离子和Fe2+，将无色的花青素催化成显色的花青素[6-9]。从生物信息学角度，以菊花为研究对象，对拟南芥、菊花、红花、辛夷、玫瑰、百合、白桑、茶共计9种药用植物的LDOX/ANS基因的核苷酸及氨基酸序列的组成、理化性质、信号肽、亲疏水性、二级结构、三级结构和进化关系等进行预测和分析。研究结果显示，菊花ANS基因全长1 238 bp，含有1个完整的开放阅读框序列，氨基酸为353个。ANS蛋白分子质量为39.59 kD，属于稳定蛋白，ANS属于非分泌性蛋白，亚细胞定位位于细胞质，没有跨膜结构域，与信号肽预测结果一致。对菊花ANS二级结构域三级结构的分析表明，菊花具有稳定的青花素合成酶结构，推断在青花素代谢途径中，菊花ANS基因保守，意味着代谢中具有重要的、不可替代的作用。通过3种系统进化分析方法得到的结果一致较高，其中菊科红花和菊科菊花在3种统计中的结果高度一致，在进化分支上，得到的结果都是分为一支，这与形态学上的分类是一致的。结果显示，菊花ANS基因及蛋白质理化性质、空间结构等多个方面与其他植物有较高的一致性，推测菊花ANS基因的重要性与其他植物生物学功能具有相同或相似的特点，后期如开展实验可以进一步验证。