长链非编码RNA MIR22HG通过微小RNA-9-3p调节CTLA4抑制前列腺癌

张 伟, 施春梅, 朱 华, 顾栋华, 潘晓东, 陈新凤, 郑 兵

(南通大学第二附属医院/江苏省南通市第一人民医院 泌尿外科, 江苏 南通, 226000)

前列腺癌是男性发病率较高的恶性肿瘤之一，目前临床降低其病死率最有效的方法是早期诊断，并在前列腺癌发生扩散之前即进行介入治疗[1-2]。长链非编码RNA(LncRNA)可以通过表观遗传、转录和转录后机制参与肿瘤发生、生长和转移等多种生物学过程。其中, LncRNA MIR22HG(简称MIR22HG)位于染色体17p13.3, 该染色体区域在肝癌等恶性肿瘤中表现为缺失、高甲基化或表现为杂合性缺失[3], 提示MIR22HG的异常表达可能参与了恶性肿瘤的发生发展。研究[4]显示, MIR22HG通过调节微小RNA-9-3p (miR-9-3p)影响骨关节炎进展，此外MIR22HG 作为竞争性内源性 RNA发挥作用，与蛋白质、miRNA相互作用参与肿瘤的发生和进展。MIR22HG可提高免疫治疗、靶向治疗对癌症的疗效[5]。细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4 (CTLA4)是目前癌症免疫治疗研究领域较为热门的基因。本研究拟分析MIR22HG/miR-9-3p是否能通过调节CTLA-4影响前列腺癌，以期为前列腺癌的免疫治疗提供参考，现报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 组织、细胞及动物: 收集本院26例前列腺癌组织样本和26例前列腺增生组织样本。本研究经院伦理委员会批准，所有受试者或家属了解本研究的内容和目的，并签署知情同意书。人胚肾细胞HEK293和人前列腺癌细胞VCAP、PC3、LNCap、DU145均购自中国科学院上海生命科学研究所细胞库。BALB/c裸鼠购自江苏集萃药康生物科技股份有限公司。

1.1.2 主要细胞、分子和化学试剂: MEM培养基和RPMI-1640培养基购自美国Gibco公司; 胎牛血清购自四季青; RNA提取试剂盒购自美国Omega公司; 脂质体Lipofectamine 3000购自美国Invitrogen公司; Opti-MEM培养基购自美国Gibco公司; 海肾荧光素酶报告基因检测试剂盒购自美国Promega公司; 无RNase水和逆转录相关试剂购自美国Thermo Fisher公司; SYBR Green荧光定量试剂盒购自美国Bio-rad公司; Western blot相关试剂购自碧云天; CTLA4兔抗购自美国Abcam公司公司(ab237712); 羊抗兔二抗购自美国Abclonal公司(AS014); ECL显色液购自美国Millipore公司; 异丙醇等化学试剂购自国药集团; 戊巴比妥钠购自美国Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养和转染: ① 细胞培养。VCAP细胞以含10%胎牛血清的MEM培养基进行培养, PC3细胞、LNCap细胞和DU145细胞均以含有10%胎牛血清的RPMI-1640培养基进行培养。所有细胞均置于37 ℃、5% CO2的恒温箱中培养。② 细胞筛选及转染。将处于生长指数期的VCAP、PC3、LNCap和DU145细胞以5×104个细胞/孔接种到12孔板中，采用“1.2.2”项下的方法筛选出MIR22HG及miR-9-3p mRNA表达较高的细胞以进行下一步研究。按照5×104个细胞/孔将上述筛选出的细胞接种到12孔板中，待细胞完全贴壁后，按照每孔1 mL Opti-MEM培养基、1 μg质粒和2 μL Lipofectamine 3000的比例进行细胞转染，分别转染miR-9-3p及CTLA4, 转染4 h后，吸去12孔板中的转染试剂，并加入新的细胞培养使用的培养基。将细胞分为OE-CTLA4(CTLA4过表达组)、OE-MIR22HG(MIR22HG过表达组)、miR-9-3p mimic (miR-9-3p过表达组)、OE-MIR22HG+miR-9-3p mimic (MIR22HG及miR-9-3p联合过表达组)、OE-NC+NC mimic(转染对照组)、NC mimic (miR-9-3p过表达对照组)。

1.2.2 实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR): 组织及细胞总RNA提取步骤参考Omega试剂盒的产品说明书。抽提所得的RNA使用Thermo Fisher的Nanodrop 2000仪器进行质检，并检测RNA浓度。根据浓度计算逆转录时使用RNA的体积。使用Thermo Fisher的逆转录试剂盒，将1 μg的RNA逆转录为cDNA。逆转录反应体系和逆转录反应程序参考Thermo Fisher的产品说明。使用无Rnase水稀释cDNA 10倍，进行qRT-PCR, qRT-PCR扩增条件为50 ℃ 2 min, 95 ℃ 2 min, 95 ℃ 15 s, 60 ℃ 1 min, 40个循环。MIR22HG引物为: 上游5′-AAGTTGGAGAGCCTTTGCCC-3′; 下游5′-CGCACTATGGTGCCACATCT-3′。miR-9-3p引物：上游5′-GCGGCGGATAAAGCTAGATAAC-3′, 下游5′-ATCCAGTGCAGGGTCCGAGG-3′。CTLA4引物：上游5′-TTTGCTGGACTTACCTTCCTTG-3′, 下游5′-CAGTATCTCGCAGTTCCAAACA-3′。内参分别为GAPDH(引物：上游5′-CAGCCTCAAGATCATCAGCA-3′, 下游5′-TGTGGTCATGAGTCCTTCCA-3′)和U6(引物：上游5′-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3′, 下游5′-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3′)。计算并比较前列腺癌组织和正常前列腺增生组织的VCAP细胞、PC3细胞、LNCap细胞与DU145细胞中MIR22HG及miR-9-3p mRNA相对表达，所有样本均重复3次，取均值。选择3种前列腺癌细胞中MIR22HG及miR-9-3p mRNA表达相对较高者进行下一步研究。

1.2.3 荧光素酶报告基因实验: 将PC3细胞接种于24孔板内，培养24 h。人工构建miR-9-3p野生型启动子双荧光素酶报告基因载体pGL4.10-hRluc，将miR-9-3p预测结合位点突变的突变体Mut-miR-9-3p和MIR22HG双荧光素酶报告基因载体共同转染PC3细胞。转染48 h后，吸出培养基，磷酸盐缓冲液(PBS)洗2遍，收集并裂解细胞，将生长培养基吸尽, PBS漂洗，加入1×PLB裂解液室温摇床充分裂解，以荧光素酶底物发光检测仪测定荧光信号，重复3次。

1.2.4 蛋白质印迹法(Western blot): 以RIPA裂解液4 ℃孵育30 min裂解细胞，将裂解的细胞移至1.5 mL的EP管, 12 000 g 4 ℃离心15 min, 收集上清液。向上清液加入蛋白上样缓冲液(loading buffer), 加热煮沸5 min, 取20 mg的蛋白样品，以10% 十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE), 电泳参数0.3 A、20 V, 转至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜。5%脱脂奶粉封闭60 min, 加入CTLA4兔抗[洗膜缓冲液(TBST)稀释，工作浓度1∶3 000], 4 ℃孵育过夜, TBST洗膜3次，加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗兔二抗, 25 ℃孵育60 min, TBST洗膜6次, ECL显色，重复3次。

1.2.5 前列腺癌异种移植模型的建立: 取裸鼠96只，将经不同处理的PC3细胞制成50 μL含有1×106个/mL细胞的悬液，即过表达MIR22HG和miR-9-3p, 合并50 μL Matrigel溶液注射在裸鼠的右腹股沟部，构建前列腺癌细胞的异种移植小鼠模型。将构建的小鼠模型分为OE-NC+NC mimic组(对照组)、OE-MIR22HG组(MIR22HG过表达组)及OE-MIR22HG+miR-9-3p mimic组(MIR22HG及miR-9-3p过表达组)，每组32只。以接种细胞当日记为第0天, 自接种第7天开始，每周对8只小鼠进行手术移除原位移植瘤，并统计瘤体的体质量和体积变化，共检测4周。肿瘤体积的计算公式为:V=0.8×2/3×D1×D2 (D1、D2分别为相互垂直的最长直径与短直径)。小鼠采用静脉注释3倍浓度的3%戊巴比妥钠实行安乐死。本实验已得到本院动物伦理会的批准。

1.3 统计学分析

2 结 果

2.1 前列腺癌组织及细胞MIR22HG和

miR-9-3p mRNA相对表达

与前列腺增生组织相比，前列腺癌组织中MIR22HG mRNA降低, miR-9-3p mRNA增高，差异有统计学意义(P<0.05)。前列腺癌细胞VCAP、PC3、LNCap和DU145细胞中, PC3细胞MIR22HG mRNA相对较低, miR-9-3p mRNA相对较高(P<0.05), 因此选择PC3细胞进行下一步研究。见图1。

A: qRT-PCR检测前列腺癌组织中MIR22HG的表达(与前列腺增生组织比较, *P<0.05); B: qRT-PCR检测前列腺癌组织中miR-9-3p的表达(与前列腺增生组织比较, *P<0.05); C: qRT-PCR检测前列腺癌细胞中MIR22HG和miR-9-3p的表达(与VCAP相比, *P<0.05); D: qRT-PCR检测前列腺癌组织、前列腺癌细胞中MIR22HG和miR-9-3p的表达(1: 前列腺癌组织; 2: 正常前列腺增生组织; 3: VCAP; 4: PC3; 5: LNCap; 6: DU145)。图1 前列腺癌组织及细胞的MIR22HG和miR-9-3p mRNA相对表达

2.2 MIR22HG靶向抑制miR-9-3p的表达

通过TargetScan网站(http://www.TargetScan.org)预测MIR22HG和miR-9-3p的靶向关系。在PC3细胞中成功过表达MIR22HG, 通过荧光素酶报告基因实验验证了MIR22HG和miR-9-3p的靶向抑制关系。过表达MIR22HG, miR-9-3p表达显著下调(P<0.05), 结果表明MIR22HG可以靶向结合miR-9-3p, 并抑制其表达。见图2。

A: MIR22HG和miR-9-3p的靶向作用位点; B: qRT-PCR检测MIR22HG的过表达效率(与OE-NC比较, *P<0.05); C: 荧光素酶报告实验检测MIR22HG和miR-9-3p的靶向作用(与OE-NC比较, *P<0.05); D: qRT-PCR检测过表达MIR22HG后, miR-9-3p的表达(与OE-NC比较, *P<0.05)。图2 MIR22HG靶向抑制miR-9-3p的表达

2.3 MIR22HG通过抑制miR-9-3p调控免疫基因CTLA4

TargetScan数据库(http://www.TargetScan.org/)预测免疫基因CTLA4与miR-9-3p的靶向关系。在PC3细胞中成功过表达CTLA4, 通过荧光素酶报告基因实验验证miR-9-3p与CTLA4的靶向抑制关系。过表达miR-9-3p,CTLA4表达显著上调(P<0.05), 结果表明miR-9-3p可能靶向激活CLTA4的表达。见图3。

A: miR-9-3p和CTLA4的靶向作用位点; B: qRT-PCR检测过表达CTLA4后, CTLA4 mRNA表达(与OE-NC比较, *P<0.05); C: Western blot检测过表达CTLA4后, CTLA4蛋白表达(与OE-NC比较, *P<0.05); D: qRT-PCR检测过表达miR-9-3p后, CTLA4 mRNA表达(与NC mimic比较, *P<0.05); E: Western blot检测过表达miR-9-3p后, CTLA4蛋白表达(与NC mimic比较, *P<0.05); F: 荧光素酶报告实验检测miR-9-3p和CTLA4的靶向作用(与NC mimic比较, *P<0.05); G: qRT-PCR检测过表达MIR22HG和miR-9-3p后, CTLA4的表达情况(与OE-NC+NC mimic比较, *P<0.05); H: Western blot检测过表达MIR22HG和miR-9-3p后, CTLA4的表达情况(与OE-NC+NC mimic比较, *P<0.05)。图3 MIR22HG通过抑制miR-9-3p调控免疫基因CTLA4

2.4 MIR22HG负调控CTLA4抑制前列腺癌细胞

与OE-NC+NC mimic组比较, OE-MIR22HG组裸鼠皮下肿瘤的质量和体积均减小，差异有统计学意义(P<0.05)。OE-MIR22HG+miR-9-3p mimic组裸鼠皮下肿瘤的质量和体积与OE-NC+NC mimic组比较，差异无统计学意义(P>0.05)。见图4。

3 讨 论

在过去10年中，各种实体瘤的免疫治疗实验数量大幅增加，癌症免疫治疗取得了突飞猛进的发展，越来越多的癌症预后预测因子被鉴定并验证[6-7]。手术后化疗和/或放疗仍然是许多实体瘤的主要治疗方法，但免疫治疗正在迅速与其他疗法结合，可改善患者生存率。免疫治疗在前列腺癌中的治疗效果有较高提升空间[8]。研究[9]表明，炎症在前列腺癌的生长和转移不同阶段起着重要作用。从前列腺炎症发作开始，各种信号通路在耐药性和免疫抑制的发展中发挥关键作用[10-11]。

A: 皮下肿瘤质量(与OE-NC+NC mimic组比较, *P<0.05; 与OE-MIR22HG组比较, #P<0.05);B: 皮下肿瘤体积(与OE-NC+NC mimic组比较, *P<0.05; 与OE-MIR22HG组比较, #P<0.05)。

本研究结果显示，前列腺癌的MIR22HG呈低表达, miR-9-3p呈高表达。研究[12]显示, MIR22HG在结直肠癌、胃癌、肝细胞癌、肺癌和甲状腺癌等恶性肿瘤组织呈低表达，其作为竞争性内源性RNA (ceRNA)参与信号通路，与蛋白质相互作用参与肿瘤进展, MIR22HG低表达的癌症患者预后较差。miR-9-3p在甲状腺乳头状癌等恶性肿瘤组织呈高表达，下调miR-9-3p可逆转甲状腺乳头状癌细胞的上皮间质转化，从而降低甲状腺乳头状癌的侵袭和迁移活性，提示miR-9-3p具有促癌作用[13]。本研究通过TargetScan网站及荧光素酶报告基因实验，验证了MIR22HG与miR-9-3p的靶向抑制关系，与相关研究[14]中MIR22HG通过靶向调节miR-9-3p表达影响喉癌进展的结果相一致。

TargetScan数据库及荧光素酶报告基因实验验证miR-9-3p与CTLA4存在靶向抑制关系，过表达miR-9-3p的CTLA4的表达也显著上调，表明miR-9-3p可以靶向激活CLTA4的表达。CLTA4是活化T细胞表面表达的膜蛋白，对T细胞增生起负性调节作用，在自身免疫性疾病的发病中具有重要作用。CLTA4已被广泛应用于免疫治疗恶性肿瘤，如伊匹单抗通过作用于CTLA-4达到免疫治疗前列腺癌的目的。本研究进一步通过裸鼠研究证实了上述论点，即分别构建过表达MIR22HG及过表达MIR22HG和miR-9-3p的前列腺癌细胞的异种移植小鼠，动态检测接种后1～4周瘤体的质量、体积变化，结果显示, OE-MIR22HG组裸鼠皮下肿瘤的质量和体积均显著减小, MIR22HG及miR-9-3p联合过表达组裸鼠皮下肿瘤的质量和体积与OE-NC+NC mimic差异无统计学意义，提示MIR22HG的抑癌作用可被过度表达的miR-9-3p抑制。但本研究存在不足，尽管本研究TargetScan数据库及荧光素酶报告基因实验验证miR-9-3p与CTLA4存在靶向抑制关系，但miR-9-3p与CTLA4的关系鲜有文献报道支持，本研究也未进行CTLA4细胞转染裸鼠的在体研究验证，因此未来还需进一步确认。

综上所述, MIR22HG与miR-9-3p存在靶向负调节关系, miR-9-3p与CTLA4存在靶向调节关系, MIR22HG/miR-9-3p可能通过抑制CTLA4达到免疫治疗前列腺癌的目的。