皮肤创面愈合中血管生成素样蛋白4的作用及机制的研究进展

杨 元, 俞程浩, 左 睿, 刘 喆, 傅 奕, 侯瑞兴

(1. 扬州大学医学院教学医院苏州瑞华骨科医院, 江苏 苏州, 215104;2. 苏州大学苏州医学院, 江苏 苏州, 215123; 3. 苏州大学基础医学与生物科学学院, 江苏 苏州, 215123)

血管生成素样蛋白4(ANGPTL4)是一种多功能细胞因子, 在人体各组织中广泛表达，在伤口愈合的过程中, ANGPTL4不仅可以影响炎症反应的进程，而且能促进角质细胞的迁移和分化、内皮细胞的增生以及减少瘢痕相关胶原的表达，从而在皮肤愈合的炎症期和增殖期发挥着重要的作用。本研究对ANGPTL4在皮肤创面愈合中的作用及机制综述如下。

1 ANGPTL4

1.1 ANGPTL4的结构

ANGPTL4是一种分泌性糖蛋白，于2000年由研究学者在筛选PPAPα1的新标靶时被发现，属于血管生成素样蛋白家族的成员[1]。ANGPTLs家族的8个成员中，有7个在人和小鼠中表达, ANGPTL5仅在人体中表达[2]。人ANGPTL4基因位于染色体19p13.3上，由7个外显子和6个内含子组成。ANGPTL4的cDNA全长1 943 bp, 编码406个氨基酸，相对分子质量为50 kDa[3]。ANGPTL4与家族中的ANGPTL3、ANGPTL8具有高度同源性，其结构类似于血管生成素[4]。全长ANGPTL4蛋白在161～164位氨基酸处可被蛋白转化酶酶解，得到1个N端卷曲螺旋四级结构域(CCD)和1个C端纤维蛋白原结构域(FLD)[5]。这2个结构域已被证实具有不同的生物学功能, N-端结构域负责抑制脂蛋白脂肪酶(LPL)的作用，可将LPL的活性形式转化为非活性形式; C末端参与血管生成、伤口愈合等功能[6]。在人体中, ANGPTL4在许多组织中广泛表达，包括心脏、肝脏、骨骼肌、脂肪和皮肤组织等[7-8]。

1.2 ANGPTL4的功能

近年来研究[9-10]表明, ANGPTL4在脂质代谢、肿瘤发生发展以及炎症等方面都发挥了重要的调控作用。脂质水平被认为是冠状动脉疾病的主要危险因素，作为一种脂质诱导因子, ANGPTL4可以通过抑制LPL的活性而导致甘油三酯蓄积，继而引发动脉粥样硬化。较多研究[11-12]发现, ANGPTL4的表达水平在多种肿瘤中上调，例如肾癌、舌鳞状细胞癌、胃癌等，并且与肿瘤的不良愈后相关。缺氧是肿瘤发生发展的重要因素，在缺氧状态下，低氧诱导因子-1(HIF-1)可介导ANGPTL4表达增加，并且与缺氧时间呈正相关，而高表达的ANGPTL4还能增强肿瘤的恶性表型，例如血管生成、侵袭、转移以及耐药性等。

ANGPTL4的异常表达与炎症性疾病的发生及发展也相关。在急性肺损伤中，由中性粒细胞过度激活导致的氧化应激是其发病的关键因素。在急性肺损伤小鼠的肺组织内, ANGPTL4表达上调，转染ANGPTL4 siRNA后，小鼠肺组织中的中性粒细胞浸润减轻，肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和白细胞介素-6(IL-6)含量减少，表明ANGPTL4的下调对急性肺损伤具有保护作用[13]。ZHANG X Y等[14]报道，炎症性肠病(IBD)患者血浆中的ANGPTL4浓度高于健康对照组，对其机制进行研究发现，在ANGPTL4基因敲除的IBD模型小鼠的肠道中, CD8+T细胞和巨噬细胞浸润增加; 加入重组ANGPTL4则可以减少CD8+T细胞和巨噬细胞的聚集，从而减轻炎症; 该研究证实了在IBD模型小鼠中, ANGPTL4可通过下调CD8+T细胞的活性起补偿性保护作用，可为IBD的临床治疗提供新的思路。

2 ANGPTL4与创面愈合的关系

皮肤创面愈合通过不同的重叠阶段进行: 止血、炎症、增殖和重塑。止血在组织损伤后立即发生，并通过募集多种免疫细胞引起炎症[15], 进而破坏细菌、清除坏死组织[16]; 增殖期协调表皮再上皮化和真皮修复[17-18]; 创面愈合的重塑阶段则是去除不再需要的细胞，并诱导细胞外基质重塑[19-20]。ANGPTL4主要参与皮肤创面愈合的炎症期和增殖期。

2.1 ANGPTL4在创面愈合炎症期的作用

炎症期需要多种免疫细胞(例如中性粒细胞、巨噬细胞、淋巴细胞等)的共同参与。中性粒细胞是血液中最丰富的白细胞，其引导宿主对感染或组织损伤的第一波防御。中性粒细胞是强大的效应细胞，通过吞噬作用、脱颗粒、活性氧簇(ROS)和中性粒细胞胞外陷阱来抵御感染性威胁，快速清除病原体和组织碎片，以利于后续的组织修复[21]。随后，凋亡的中性粒细胞可被巨噬细胞吞噬，这也预示着创面愈合开始从炎症期转变至增殖期[22]。巨噬细胞在炎症中的作用较为复杂，不同的微环境可诱导巨噬细胞发生形态和功能的改变。M1巨噬细胞可以分泌多种促炎性因子，例如TNF-α、IL-6等，具有较强的抗微生物和抗肿瘤活性，但会损害组织再生和伤口愈合; M2巨噬细胞合成并分泌抗炎性因子，例如IL-10、TGF-β等，具有抗炎的作用[23]; 此外，巨噬细胞还可以介导成纤维细胞的增殖、血管再生和胶原生成等[24-25]。

ANGPTL4可调控中性粒细胞和巨噬细胞的功能。Wei等[26]发现,ANGPTL4基因敲除小鼠伤口炎症时间延长，其原因是ANGPTL4的缺乏导致了伤口微环境中单核细胞来源的巨噬细胞减少，滞留在伤口处的中性粒细胞只有少量被巨噬细胞吞噬，从而使中性粒细胞的存在时间延长，表明ANGPTL4可通过加速巨噬细胞对中性粒细胞的吞噬作用，促进皮肤愈合过程从炎症期转变为增殖期，从而加快皮肤创面的愈合进程。此外，在人和小鼠结肠癌细胞中加入重组ANGPTL4蛋白后发现, ANGPTL4可促进M2型巨噬细胞的诱导分化，促进肿瘤细胞的生长和转移[27]。JUNG K H等[28]研究发现, ANGPTL4在胰腺炎患者的血清和胰腺组织中的表达增加，高表达的ANGPTL4可促进M1型巨噬细胞活化和浸润，并通过激活PI3K/AKT信号通路增加补体组分5a(C5a)的水平，而C5a受体的激活又可引起高细胞因子血症，进一步加速腺泡细胞的损伤并加剧胰腺炎。上述研究表明，在不同的组织和细胞中, ANGPTL4调节巨噬细胞的机制不尽相同，既可以激活M1型巨噬细胞发挥促炎的作用，也可以活化M2型巨噬细胞起到抗炎的作用。

2.2 ANGPTL4在创面愈合增殖期的作用

在创面愈合过程中，增殖期主要包括再上皮化和真皮的修复。参与再上皮化的细胞主要是角质形成细胞。角质形成细胞是伤口完成再上皮化中最为关键的细胞，任何影响角质形成细胞迁移、增殖和分化的因素均能对伤口最后的愈合造成影响[29]。研究[30]发现，在野生型小鼠皮肤伤口造模后, ANGPTL4的表达迅速升高，第3天到达高峰; 随着伤口的愈合, ANGPTL4的表达逐渐减弱，直至恢复到初始水平，伤口约在第7天完全愈合;ANGPTL4基因敲除的小鼠在第10天完成伤口的再上皮化，再上皮化过程中的表皮组织厚度和新生上皮的长度、面积均明显低于野生型小鼠，并且表皮组织Ki67阳性细胞数也明显降低，其机制与ANGPTL4调控整合素信号有关。整合素是一种细胞膜蛋白，由其介导的细胞外基质黏附在皮肤创伤愈合中起着重要而复杂的作用; 整合素在愈合的每个阶段调节多种细胞并能激活众多信号途径，包括调控细胞周期、细胞迁移、细胞凋亡等，而且能在创伤愈合中与生长因子协同产生作用[31]。GOH Y Y等[30]发现ANGPTL4可以与整合素β1和β5相互作用，通过调节整合素-FAK-Src-PAK1信号通路的活性，促进角质形成细胞的迁移，进而促进皮肤伤口愈合。PAL M等[32]研究证实ANGPTL4可激活JunB和c-jun, 并分别与蛋白激酶C和转谷氨酰胺酶1基因的启动子区域结合，促进角质形成细胞的分化。上述证据表明, ANGPTL4可以通过促进角质形成细胞的迁移和分化，促进伤口的再上皮化。

创面愈合增殖期真皮的修复包括肉芽组织的出现、瘢痕的形成等，参与修复的主要细胞是成纤维细胞。在细胞因子等因素的调控下，成纤维细胞发生增殖、迁移并合成分泌胶原蛋白、细胞外基质以及胶原酶等，参与肉芽组织的形成、伤口的收缩、瘢痕的形成及组织重建的过程[33]。JAMIL S等[34]观察到在ANGPTL4基因敲除的小鼠中，肌腱的愈合速度减缓，随后在分离的小鼠肌腱成纤维细胞中，通过MTS和细胞划痕实验证实了ANGPTL4可以促进肌腱成纤维细胞的增殖和迁移。癌相关成纤维细胞是近些年肿瘤研究的热点，在癌细胞分泌的生长因子或细胞因子的刺激下，正常的成纤维细胞可以分化为癌相关成纤维细胞，后者转而促进癌细胞的增殖和转移。ANGPTL4可以诱导肿瘤微环境中癌症相关成纤维细胞的活化，并通过ERK信号通路促进结肠癌(CRC)细胞发生上皮间质转化，进而促进结肠癌细胞的侵袭和转移[35]。

在皮肤创伤中，成纤维细胞生成的胶原蛋白可帮助重建皮肤屏障，但由此产生的瘢痕却影响了功能和美观。TEO Z等[36]发现ANGPTL4可与钙黏蛋白-11结合，释放膜结合的β-连环蛋白，后者转位到细胞核，并在转录水平上调ID3的表达，从而抑制成纤维细胞生成瘢痕相关胶原蛋白1α2和3α1, 减少了瘢痕的形成，为瘢痕的预防性治疗提供新思路。

新生血管的形成也是伤口愈合增殖过程中重要的阶段之一。在表皮细胞、巨噬细胞和血管内皮生长因子信号等的作用下，血管前缘或尖端的内皮细胞可分支或萌发形成新的血管。在血管生成过程中，内皮细胞允许免疫细胞及其他循环细胞通过并渗入伤口，而ANGPTL4有显著的促肿瘤血管增殖和增加血管渗透性的作用。有研究[37]发现，相比野生小鼠移植瘤模型，血管内皮细胞标记物CD31在ANGPTL4基因敲除的小鼠体内肿瘤中持续低表达，提示ANGPTL4可促进肿瘤血管生成。WU Y X等[38]报道, ANGPTL4在卵巢癌细胞中过表达，而敲减ANGPTL4则对肿瘤血管的生成、肿瘤细胞的生长和体内转移表现出显著的抑制作用。在伤口愈合方面, CHONG H C等[39]发现糖尿病小鼠的皮肤伤口处ANGPTL4表达减少，伤口愈合延迟; 局部应用重组ANGPTL4蛋白可使伤口愈合的速度加快。进一步研究发现，外源性ANGPTL4可增加糖尿病小鼠皮肤伤口中CD31的表达和CD31+内皮细胞的数量，此机制是通过ANGPTL4刺激STAT3介导的iNOS表达，进而促进血管生成来实现的。因此, ANGPTL4在创面愈合的增殖期发挥重要作用。

3 展 望

在皮肤组织中，有一类表皮干细胞具有自我更新和强大的增殖分化潜能，是皮肤发生和稳态维持的关键细胞，尤其是皮肤创伤愈合中的再上皮化过程，由表皮干细胞启动和负责[38]。本课题组前期研究已发现ANGPTL4基因敲除小鼠与野生型小鼠相比，皮肤伤口愈合延迟，组织学实验结果显示皮肤表皮层厚度变薄，再上皮化受损，表皮干细胞数量减少，相关的机制正在进一步研究中。探讨ANGPTL4对表皮干细胞的作用及机制，不仅能完善ANGPTL4的功能，还能加深对皮肤组织稳态维持机制的理解，为临床治疗皮肤创面提供有价值的策略。