泽泻叶三萜的制备及其对磺胺间甲氧嘧啶钠在大鼠体内代谢的影响

2023-01-06王榆鑫陶梦婷赵宇哲李丽霞

四川农业大学学报 2022年6期

王榆鑫，陶梦婷，张淇，赵宇哲，兰坤，陶超，李丽霞

（四川农业大学动物医学院，成都 611130）

泽泻为泽泻科植物东方泽泻Alisma orientate(Sam.)Juzep.或泽泻Alisma plantago-aquatica Linn.的干燥块茎[1]，具有利水渗湿、化浊降脂等功效，用于小便不利、水肿胀满等病症[2]。泽泻的活性成分主要是三萜类成分[3]，具有降血脂[4]、抗动脉粥样硬化[5]、利尿[6]等药理活性。泽泻以块茎入药，泽泻叶作为生产废料，处理费工，污染环境，且增大泽泻种植的连作障碍。课题组前期研究结果表明，泽泻叶和泽泻块茎具有非常相似的三萜类成分。

磺胺类药物是一类广谱抑菌药物，性质稳定、价格低廉，作为兽药广泛用于家畜养殖中。这些药物进入动物体内后，可残留在肉、蛋等动物性食品中，并会在食用者体内蓄积，影响其健康[7]。磺胺间甲氧嘧啶（sulfamonomethoxine，SMM）属于长效磺胺类药物，其在磺胺类药物中对动物细菌性感染和抗球虫的预防和治疗作用最强，但其在动物体内清除时间较长，休药期长达28天。如果未清除完全，会随着畜牧肉类进入人体，蓄积到一定程度会破坏人的正常免疫机能、造血系统、脑神经系统和消化系统，且会导致微生物产生抗性基因，对生物体的生育能力和甲状腺造成影响[8]。

本试验基于前期研究基础和泽泻叶的组织结构特点，采用复合酶酶解法从泽泻叶中提取总三萜类成分，并通过测定血药浓度，研究其对磺胺间甲氧嘧啶钠在大鼠体内代谢的影响，以期为寻找一种天然的、能有效缩短抗生素休药期的天然药物奠定基础，为泽泻叶的综合开发利用提供依据。

1 材料和方法

1.1 实验材料

SPF级雄性SD大鼠30只，体质量（200±20）g，购自成都达硕实验动物有限公司，合格证号SCXK（川）2020-030。

1.2 药材与试剂

泽泻叶（采自四川省眉山市沣硕中药材合作社，经李丽霞老师鉴定为泽泻Alisma plantagoaquatica Linn），阴干后剪碎备用。10万U/g木瓜蛋白酶（南宁庞博生物工程有限公司）；5 000 U/mL中性纤维素酶（沧州夏盛酶生物技术有限公司）；磺胺间甲氧嘧啶钠标准品（含量≥99%，四川拜耳动物保健有限公司）；高氯酸（成都金山化学试剂有限公司）；生理盐水（四川科伦药业股份有限公司）；无水乙醇、香草醛、乙酸乙酯、冰醋酸、氨水、正己烷和盐酸等为分析纯，甲醇、乙腈和磷酸等为色谱纯(成都市科隆化学品有限公司)。

1.3 仪器设备

ZDHW型电热套、DZKW-4型电子恒温水浴锅（北京中兴伟业仪器有限公司）；RE-2000E型旋转蒸发仪（郑州科泰实验设备有限公司）；DHG-2080B型电热恒温鼓风干燥箱（郑州生元仪器有限公司）；ST16R型大容量高速台式冷冻离心机、多功能荧光化学发光免疫仪（赛默飞世尔科技（中国）有限公司）；JHD-003型水浴氮吹仪（上海极恒实业有限公司）；1260 InfinityⅡ型高效液相色谱仪（安捷伦科技（中国）有限公司）。

1.4 复合酶酶解工艺优化指标的测定方法

1.4.1 粗三萜得率的计算

粗三萜得率（%）=（粗三萜质量/泽泻叶质量）×100%

1.4.2 总三萜含量测定

1.4.2.1 标准曲线的建立

参照石峰等[9]的方法并稍作修改。精密称取23-乙酰泽泻醇B对照品1.26 mg，于25 mL容量瓶中，加适量乙醇溶解，摇匀，定容，得到质量浓度为0.050 4 mg/mL的23-乙酰泽泻醇B对照品溶液。精密吸取对照品溶液0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2，1.4 mL于10 mL的试管中，在60℃水中将溶剂挥干，挥干后于试管中加入0.2 mL的5%香草醛冰乙酸溶液、0.8 mL高氯酸，60℃水浴15 min，冷却5 min，加冰醋酸5.0 mL，摇匀，于555 nm波长处测定。以23-乙酰泽泻醇B含量为横坐标，纵坐标为吸光度绘制标准曲线，得到线性回归方程为Y=8.523X-0.038 5（R2=0.999 6）。

1.4.2.2 样品总三萜含量的测定

取所得的泽泻叶粗三萜0.01 g置于10 mL的容量瓶中，用85%乙醇稀释至刻度，摇匀，即得供试品溶液。精密移取供试品溶液0.2 mL，后续操作按1.4.2.1项下的方法进行，随行乙醇空白，在555 nm处测定吸光度，根据线性回归方程计算总三萜的含量。

总三萜含量（%）=（三萜质量/粗三萜质量）×100%

1.4.3 总三萜提取率的计算

总三萜提取率（%）=（粗三萜得率×总三萜含量）×100%

1.5 单因素试验

1.5.1 复合酶比例的筛选

称取5 g泽泻叶，固定料液比为1∶20，分别加入纤维素酶与木瓜蛋白酶比例为（1∶1、1∶2、2∶1、2∶3、3∶2）的复合酶1.2%，自然pH，酶解90 min。升温至100℃灭酶。弃去酶解液，向圆底烧瓶中加入料液比为1∶20的85%乙醇，在100℃下，冷凝回流浸提2 h，提取2次，合并提取液，得泽泻叶总三萜。以泽泻叶总三萜提取率为指标，优选最佳复合酶比例。试验平行3次，结果取平均值。

1.5.2 复合酶酶解的单因素筛选

按照1.5.1项下的酶解方法，控制纤维素酶与木瓜蛋白酶比例为1∶2，分别以酶解时间（30、60、90、120、150 min）、酶用量（0.8%、1.0%、1.2%、1.4%、1.6%）、料液比（1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30）和酶解温度（30℃、40℃、50℃、60℃、70℃）为自变量进行试验，以泽泻叶总三萜提取率为指标，优选最佳工艺参数。每组试验重复3次，结果取平均值。

1.6 响应面法优化

在单因素试验的基础上，以泽泻叶总三萜提取率作为响应值，选取影响较显著的3个因素：料液比、酶解温度和酶解时间作为考察因素，设计3因素3水平响应面优化试验进行分析。响应面分析因素水平如表1所示。

表1 Box-Behnken响应面实验因素水平表Table 1 Box-Behnken test factors and the level of design

1.7 泽泻叶总三萜提取物的精制

取泽泻叶粗三萜提取物，按质量比1∶5加蒸馏水溶解。用等体积乙酸乙酯萃取5次，将所得萃取液浓缩烘干，即得精制三萜。按1.4.2.2项下的方法测定精制三萜中三萜的浓度。

1.8 泽泻叶总三萜提取物对磺胺间甲氧嘧啶钠在大鼠体内代谢的影响

1.8.1 动物分组及给药

将30只雄性SD大鼠随机分为5组，每组6只，分别标记为空白组、模型组、总三萜高（1.6 g/kg）、中（0.8 g/kg）和低（0.4 g/kg）剂量给药组。适应性喂养7 d开始进行正式试验。给药组每天上午10:00灌胃给药一次，灌胃体积为1 mL/100 g，模型组和空白组灌予相同体积的生理盐水。给药三天后，禁食12小时，自由饮水，除空白组外，其余各组按100 mg/kg剂量灌胃给予磺胺间甲氧嘧啶钠，灌胃体积为1mL/100g，空白组给予相应体积生理盐水，在灌胃后0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、24、48、72、96、120、144、168 h通过眼眶静脉采血，各血样在4℃，3 500 r/min离心10 min，分离血浆，于-20℃保存待测。

1.8.2 固相萃取-高效液相色谱法测定血浆中SMM-Na含量

1.8.2.1 色谱条件

色谱柱：Inertsil ODS-3液相色谱柱（4.6×250 nm，5µm）；流动相：0.02 mol/L磷酸∶乙腈（80∶20），三乙胺调节pH至3.5；检测波长：230 nm；流速：1 mL/min；柱温：30℃。

1.8.2.2 标准曲线的建立

参照罗园[10]已建立的方法进行试验。用流动相配制SMM-Na溶液，取配好的SMM-Na溶液100µL加入到400µL空白血浆中，使得血浆中SMM-Na质量浓度分别为100.0、50.0、25.0、5.0、2.5和1.0 µg/mL，另吸取双蒸水100µL于400µL空白血浆中，作空白组对照。按照1.8.2.3项下血浆样品的预处理方法处理后采用HPLC法进行检测。以血浆药物浓度C为横坐标，药物峰面积A为纵坐标绘制标准曲线，得到回归方程为A=42.205C-19.362（R2=0.999 7）。

1.8.2.3 待测样品的制备

取血浆样品0.5 mL，加入乙腈1 mL，涡旋混匀2 min，5 000 r/min，离心5 min，取上清液至离心管中。残渣再加入乙腈1 mL重复以上操作，合并两次上清液并用氮气吹干，向离心管加入0.1 mol/L HCl 2 mL和正己烷1 mL，超声清洗，洗液转入10 mL离心管中，再向离心管中加入同体积的HCl和正己烷，超声清洗，合并两次清洗液，涡旋混匀后于离心机中离心5 min，转速为5 000 r/min，弃上层正己烷层，再加正己烷1 mL，涡旋混匀2 min，再弃掉正己烷，留下层为备用液。

取MCX固相萃取柱依次用甲醇2 mL和0.1 mol/L HCl 2 mL活化，取备用液过柱，控制流速1 mL/min。依次用0.1 mol/L HCI溶液1 mL和50%甲醇乙腈液2 mL淋洗，用洗脱液（5%氨水乙腈）4 mL洗脱，收集洗脱液，氮气吹干后加流动相（磷酸∶乙腈=80∶20）0.5 mL超声溶解，用0.45µm微孔滤膜过滤，按1.8.2.1项下色谱条件进行检测，记录色谱图，计算峰面积，代入标准曲线方程中，计算药物浓度。

1.9 数据处理

2 结果与分析

2.1 单因素实验

2.1.1 复合酶比例对泽泻叶总三萜提取率的影响

由图1可知，当纤维素酶与木瓜蛋白酶比例为1∶2时，泽泻叶总三萜提取率最大为0.31%，因此，复合酶的最佳比例为纤维素酶∶木瓜蛋白酶=1∶2。

图1 复合酶比例的筛选Figure 1 Screening of mixed enzyme ratio(±s,n=3)

2.1.2 酶解时间对泽泻叶总三萜提取率的影响

由图2A可知，泽泻叶总三萜提取率随着酶解时间的升高先增大后减小。从30 min至90 min，提取率从0.23%到0.30%，增幅为30.43%。随着提取时间的增加，提取率反而降低。可能是随着酶解时间的增长，酶解作用充分发挥，使得提取率增大，但时间过长，酶的催化活性降低导致提取率降低。因此，复合酶的最佳酶解时间为90 min。

2.1.3 酶用量对泽泻叶总三萜提取率的影响

由图2B可知，泽泻叶总三萜提取率随着复合酶用量的升高先增大后减小。复合酶用量从0.80%至1.20%，得到的提取率从0.28%增加到0.31%，增幅为10.71%。随着酶添加量的增加，提取率反而降低。这是由于在一定酶解条件下，酶浓度不足时，酶浓度越大裂解细胞壁的效率越高，当酶浓度到饱和后，再增加酶浓度对结果的影响就变弱了。因此，复合酶的最佳酶用量为1.20%。

2.1.4 料液比对泽泻叶总三萜提取率的影响

由图2C可知，泽泻叶总三萜提取率随着料液比的增加先增大后减小。料液比从1∶10至1∶20时，得到的提取率从0.18%增加至0.32%，增幅为77.78%。随着料液比的增加，提取率稍微降低。可能是随着溶剂增多，扩大了反应体系中泽泻叶与复合酶的接触面积，总三萜提取率增加。但随着料液比继续增加，酶浓度降低，导致酶与底物结合不充分，使提取率降低。因此，最佳料液比为1∶20。

图2 酶解时间(A)、酶用量(B)、料液比(C)、酶解温度(D)对总三萜提取率的影响Figure 2 Effects of enzymolysis time(A),enzyme dosage(B),material-liquid ratio(C),enzymolysis temperature(D)on total triterpenes yield(±s,n=3)

2.1.5 酶解温度对泽泻叶总三萜提取率的影响

由图2D可知，泽泻叶总三萜提取率随着酶解温度的升高先增大后减小。温度从30℃至50℃，得到的提取率从0.24%增加到0.41%，增幅为70.83%。随着温度的升高，酶活性降低，总三萜提取率逐渐降低。可能是复合酶在50℃时活性最强，分解细胞壁效果最佳。当温度进一步升高时，酶蛋白开始受热变性，使得酶活性逐渐降低，导致总三萜提取率下降。因此，复合酶最佳酶解温度为50℃。

以提取率的增幅为指标，由以上4个单因素的实验结果可知影响总三萜提取率高低的顺序为：料液比、酶解温度、酶解时间、酶用量。

2.2 响应面优化

2.2.1 响应面分析方案及结果

根据Box-Behnken中心组合试验设计原理，设计三因素三水平的响应面分析试验，以总三萜提取率为响应值，试验方案及结果见表2。

表2 响应面试验设计及结果Table 2 Design and results of response surface test

2.2.2 回归模型建立及方差分析

应用Design-Expert 10.0.7软件进行分析，得到多元二次回归模拟方程为Y=0.408+0.045A+0.003 7B-0.0187 5C-0.017 5AB-0.017 5AC-0.02BC-0.031 5A2-0.044B2-0.009C2，方差分析见表3。回归模型（P<0.01）极显著，相关系数明该模型R2=0.907 6，失拟项P=0.454 5（P>0.05），表明失拟项相对于绝对误差不显著，因此，该模型对试验的拟合程度良好，能较好的反映各因素与响应值之间的真实关系，可以利用该模型对实验参数进行分析。由F值的大小可判断，在所选择的试验范围内，3个因素对泽泻叶总三萜提取率影响的顺序为料液比（A）>酶解时间（C）>酶解温度（B）。此外，一次项A显著，B、C不显著；二次项B2极显著，A2显著、C2不显著。交互项AB、AC和BC均不显著。响应面分析见图3。

表3 回归模型方差分析Table 3 Variance analysis of regression model

2.2.3 验证试验

采用Design-Expert 10.0.7软件回归分析，得出当酶解料液比为1∶23.225，酶解温度为51.75℃以及酶解时间为70.77 min时，泽泻叶总三萜提取率达到最大，为0.45%。结合生产实际，将响应面法计算所得最优工艺修订为：料液比为1∶25，酶解温度50℃、酶解时间为70 min。重复实验3次，测得最终总三萜平均提取率为0.44%，与预测值（0.45%）接近，RSD值为0.36%，表明工艺稳定可行，能满足实验以及实际生产要求。

2.3 泽泻叶总三萜提取物的精制

结果表明，精制三萜中三萜含量为28.95%，比粗三萜中三萜含量6.08%有一定的提高，为后续实验提供物质基础。

2.4 泽泻叶总三萜提取物对磺胺间甲氧嘧啶钠在大鼠体内代谢的影响

色谱图结果见图5。根据回归方程计算血药浓度，绘制血药浓度-时间曲线（图4）。由图4可知，模型组血药浓度峰值出现在3.5 h，而给药组血药浓度峰值提前至2 h，血药浓度峰值和给药剂量呈负相关，模型组和给药组血药浓度的峰值均有显著性差异（P<0.05）。模型组磺胺间甲氧嘧啶钠的清除时间需要144 h，高、中和低剂量组磺胺间甲氧嘧啶钠清除时间分别为72、96和120 h，表明给药组磺胺间甲氧嘧啶钠的清除速率显著快于模型组，且药物清除速率的顺序为高剂量组>中剂量组>低剂量组，呈现一定的剂量依赖性。

图4 血浆药-时曲线图Figure 4 Plasma concentration-time curves

图5 HPLC色谱图Figure 5 HPLC chromatogram

3 讨论

酶辅助提取技术通过分解细胞壁及细胞间质中的纤维素、半纤维素等成分使有效成分溶出，在提高中药有效成分提取效率中发挥重要作用[11]。酶解有单酶法和复合酶法，常用酶有木瓜蛋白酶，中性蛋白酶，纤维素酶等。目前暂无酶解辅助提取泽泻和泽泻叶中总三萜的研究，但已有文献对泽泻块茎总三萜的提取工艺进行了报道。邓迎娜[12]、宋丽[13]和石峰[9]都用超声提取法提取泽泻总三萜，所得提取率分别为1.93%、2.63%和2.98%；易醒[14]用微波预处理泽泻后加热回流提取总三萜，所得提取率为1.78%；罗奋熔[15]采用传统直接加热回流法提取泽泻总三萜，所得提取率为0.14%。泽泻叶含有很多韧性较强的纤维，会大大影响提取效率，本实验前期研究发现木瓜蛋白酶和纤维素酶可较好提高泽泻叶三萜的提取率，木瓜蛋白酶作用于蛋白，纤维素酶作用于细胞壁，故采用复合酶辅助提取泽泻叶总三萜。实验结果证明，复合酶酶解后泽泻叶总三萜提取率显著提高，为0.44%。

目前已有研究表明中药提取物具有加速抗生素代谢的作用，如杨锐等[16]发现甘草提取物能加快氟苯尼考在鸡体内的吸收和消除速度，王培等[17]研究发现黄芩和五倍子提取物都可以促进恩诺沙星及其次级代谢产物环丙沙星的代谢和消除速率。泽泻有良好的利尿作用，研究表明泽泻乙酸乙酯部位是泽泻利尿的主要部位，并发现三萜类化合物主要集中于乙酸乙酯部位[18]。基于此，我们推测泽泻叶总三萜提取物能加速抗生素在动物体内的代谢和清除。兽用抗生素残留严重危害人体健康和环境安全，磺胺类药物（SAs）是兽医临床上常用的广谱抗生素，在动物体内清除速度慢、休药期长，常出现残留问题，如磺胺甲恶唑在大西洋庸鲽肌肉和肝脏中的清除时间分别为432 h、624 h[19]，甲氧苄啶在蛋黄中的残留清除时间长达37 d[20]。调查发现，75%肉类样品中SAs的总浓度超过100µg/kg，在鸡肉和猪肉中的最大残留量高达2 700和3 600µg/kg[21]。本实验结果显示，泽泻叶总三萜提取物高剂量组能提前72 h清除大鼠体内的磺胺间甲氧嘧啶钠，占整个清除周期的1/2，表明其能有效地加速磺胺间甲氧嘧啶钠在大鼠体内的代谢，缩短大鼠体内磺胺间甲氧嘧啶钠的代谢周期，并降低残留，为兽医临床合理用药提供了理论依据。

基于本实验结果，泽泻叶总三萜提取物会对抗生素血药浓度峰值造成影响，使峰值前移，所以在实际应用中，拟在使用了抗生素，并过了抗生素半衰期后再以口服给药的方式应用泽泻叶总三萜提取物，这样可以在不影响抗生素的使用效果的前提下，起到减少抗生素残留，缩短抗生素休药期的作用。本实验仅考虑了总三萜提取物对动物体内抗生素血药浓度的影响，未涉及组织脏器的残留，但在后续的本体动物临床实验中，会充分考虑对组织脏器，特别是会作为食品的组织脏器的影响。