5种晚熟柑橘多甲氧基黄酮提取方法比较及应用

金铮华，黄泽浩，毕晓艺，李云杰，王 迅，邓红红，古咸杰，廖 玲*

（1.四川农业大学园艺学院，成都 611130；2.绵阳市农业科学研究院，四川 绵阳 621000）

柑橘是我国南方栽培面积最广、经济地位最重要的果树[1-2]。柑橘属植物的果皮具有很高的药用价值，柑橘果皮中生物活性物质包括类黄酮、类柠檬苦素和类胡萝卜素等；类黄酮可分为黄酮、黄酮醇和黄烷酮等[3]。多甲氧基黄酮（polymethoxylated flavones，PMFs）是指含有两个或两个以上甲氧基团的天然黄酮类物质的总称，具有多种生物活性[4-6]，几乎仅存在于柑橘属中，特别是柑橘果皮中的黄酮类化合物[7-9]。如寇广宁[5]用醇提法配合超声法辅助提取大红袍红橘多甲氧基黄酮，最终检测出其总多甲氧基黄酮含量高达(283.40±13.20)mg/100 g FW。最新的医学报道中，有研究者通过计算机模拟筛选，发现橙皮苷对冠状病毒SARS-CoV-2所含蛋白酶的抑制作用，这表明将柑橘果皮运用到新型冠状病毒的防治成为可能[10]。

柑橘按成熟期分为10月底前成熟的早熟品种、11—12月成熟的中熟品种、翌年1—5月成熟的晚熟品种。晚熟柑橘对优化柑橘产业供应具有重要作用[11-12]。四川目前主栽的晚熟柑橘品有‘春见’‘大雅’‘沃柑’‘黄果柑’和‘塔罗科血橙’等。‘春见’是橘橙‘清见’与‘椪柑’F-2432杂交育成的高糖、低酸、晚熟优良杂交柑橘品种。因四川地区独特的地理优势，使得‘春见’果实品质优良，经济效益良好，深受柑橘种植户们的喜爱[13]。吴跃辉等[14]研究发现，‘春见’果实中的橙皮苷、柚皮苷集中在皮渣囊衣部分，在果肉和籽粒中几乎为零。‘大雅’是由中国柑橘研究所用‘清见’和新生系3号椪柑杂交育成，果实外观和树体均酷似‘春见’，但品质超过‘春见’。蒲成伟等[15]研究发现，‘大雅’果皮光滑，油胞密度密，极易剥皮，耐贮性中等，适合用于提取多甲氧基黄酮。‘沃柑’是‘坦普尔’橘橙和‘丹西’红橘的杂交品种，属于宽皮柑橘类型[16]。蒲成伟等[15]研究表明，‘沃柑’果皮较薄，平均厚度为0.66 mm，油胞密度密，有果皮加工的潜力。‘黄果柑’属芸香科柑橘属的橘、橙天然晚熟杂交品种，在雅安市石棉县境内已有数百年栽培历史[17]，具有特晚熟、极丰产、适应性广和易栽培等特点，仅石棉县已有0.53万hm2的种植面积[18]。李秀娟[19]用超声波辅助提取法提取‘黄果柑’、红橘和莽山野橘果皮的黄烷酮，结果显示‘黄果柑’果皮中柚皮苷含量极少，橙皮苷含量较高，且明显高于红橘和莽山野橘。‘塔罗科血橙’是芸香科柑橘属甜橙类的栽培品种，成熟期在1月中旬—2月中旬，因果肉有红色血丝或血斑而得名，其皮渣中含有丰富的果胶、维生素和橙皮苷等成分[20]。

目前对柑橘PMFs的研究主要以早、中熟品种为研究对象，且主要集中于1～2种提取方法的评价，对‘黄果柑’果皮中PMFs的提取和综合考虑多种提取方法的研究较少。如赵梓燕[21]利用震荡提取和超声提取对红橘果皮多甲氧基黄酮进行单因素试验的提取比较。当两种方法提取TPMF含量相同时，超声辅助提取用时明显小于浸渍震荡提取，表明超声波对PMFs的溶解具有显著的促进作用。‘黄果柑’作为石棉县内种植广泛，产量极高，易于栽培的生产栽培品种，具有极大的研究价值。因此本试验分别对超声提取、振荡提取和微波提取这3种方法进行优化、比较，筛选出一种简单、提取率高和经济的‘黄果柑’PMFs提取方法，并用该方法对5种晚熟柑橘果皮中PMFs含量进行对照分析，本研究为多甲氧基黄酮的分离检测提供参考。

1 材料和方法

1.1 试验材料

本试验选取位于四川省雅安市石棉县坪阳村柑橘标准示范园内长势良好、树龄树势基本一致的‘黄果柑’‘沃柑’‘春见’‘大雅’和‘塔罗科血橙’5 个品种的果树为材料，园内以枳壳为基砧，株行距为3 m×4 m，树龄5 a。该示范园地处亚热带季风气候区，以低山河谷干热气候为主，平均降水量偏少。全年干湿分明，年降水量777.4 mm，气温年较差较小，日较差较大，多年平均气温17.1℃，无霜期平均326 d，年日照实数为1 245.6 h。采摘时于果实成熟期选取每个品种果树各3棵，每株为一个处理，共3次重复，在果树的东、南、西和北4个方向树冠外围选取大小均衡、果形一致的果实各2个，每株树8个果实。

1.2 试验设计

1.2.1 样品制备

采摘后将果实洗净擦干并用冰盒带回实验室，在冰上分离果皮，将果皮剪碎成1 cm2大小的碎片装袋冷冻，以便于粉碎研磨，试验前统一用粉碎机充分研磨并置于-80℃冰箱中保存。

表1 样品信息Table1 Information of samples

1.2.2 试验方法

分别参照寇广宁[5]的超声提取方法、张元梅[22]的振荡提取方法和刘志聪[23]的微波提取方法；加以适当调整，以提取剂、时间和料液比为影响因素，每因素设定三个水平，进行三因素三水平正交实验，选用L9(33)正交实验表（表2）。所有提取均重复两次且合并提取液。

表2 提取方法正交表Table 2 Orthogonal table of multiple extraction methods

1.3 测定方法

采用紫外-分光光度计对提取液的总多甲氧基黄酮含量进行测量比较，检测波长采用330 nm[24]。以川陈皮素作为对照品[6]进行标准曲线测定制作。

1.4 数据统计与分析

数据处理采用Microsoft Excel 2016软件，数据分析采用SPSS 26进行统计分析，运用Origin 2022进行图表绘制。

2 结果与分析

2.1 标准曲线制作

精密称取川陈皮素标准品400µg，分别用甲醇、乙醇和乙酸乙酯溶解并定容，配置成含川陈皮素200µg/mL的对照品溶液备用，4℃下避光保存。用对应试剂稀释配置成7个质量浓度水平，在330 nm波长下分别测定吸光度值，并绘制标准曲线，制成下表。

2.2 精密度试验

取对照品溶液高（26µg/mL）、中（14µg/mL）和低（2µg/mL）3个质量浓度，在330 nm波长下测定吸光度，平行3次，测得其RSD值分别为0.45%、0.55%和0.40%，说明试验所用分光光度计在不同浓度下精密度良好。

2.3 不同提取方法对‘黄果柑’果皮PMFs提取量的影响

由表4可知，超声提取中，处理U2（提取剂：甲醇；时间：45 min；料液比为1∶20）的提取效果最好，为(373.961±2.069)µg/100 mg；显著高于其余8个处理。震荡提取中处理O3（提取剂：甲醇；时间：3 h；料液比为1∶30）的提取效果最好，为(345.377±0.748)µg/100 mg。显著高于其余7个处理，提取量高于O2，但与O2处理间差异不大。微波提取法中，处理M2（提取剂：甲醇；时间：45 s；料液比为1∶20）的提取效果最好，为(389.559±2.820)µg/100 mg。显著高于其余8个处理。

表3 标准曲线数据表Table 3 Standard curve data sheet

表4 ‘黄果柑’果皮PMFs 3种提取方法提取结果Table 4 The results of three extraction methods in ′Huangguogan′peel

2.4 3种PMFs提取方法的筛选

采用不同提取方法提取‘黄果柑’PMFs的效果不同，超声提取法、振荡提取法和微波提取法3种提取方法中PMFs提取量最大的处理分别为U2（373.961±2.069） µg/100 mg、O3（348.654±4.513）µg/100 mg 和 M2（389.559±2.820）µg/100 mg。其中，最有效、提取率最高的为M2处理组合（提取剂：甲醇；时间：45 s；料液比为1∶20）。

对以上3种处理进行LSD分析，结果表明，M2（提取剂∶甲醇；时间：45 s；料液比为1∶20）的提取方法对‘黄果柑’果皮中多甲氧基黄酮的提取率最高（图1）。这可能与提取过程中的作用方式相关，超声辅助提取法通过超声波的空化效应，破坏植物细胞壁来提高目标化合物的释放[9]；振荡提取法通过增大提取剂与样品间的接触，增大提取效率；而微波辅助提取法则是通过微波作用使得植物样品吸收大量的能量，而外部溶剂热量较低，从而在细胞内部产生热应力，加快植物细胞壁的破裂，使细胞内物质直接与较冷的提取剂接触，从而加快了目标产物的转移过程。所以在提取剂、料液比相同的情况下，微波提取法提取率更高，用时更短，耗能更少[23]，对‘黄果柑’果皮中PMFs的提取有明显促进作用。

图1 不同处理方法对‘黄果柑’PMFs提取量的结果Figure 1 Results of PMFs extraction from ′Huangguogan′by different treatment methods

2.5 5种晚熟柑橘间PMFs含量的比较

以2.3的3种处理方法对‘黄果柑’‘沃柑’‘春见’‘大雅’和‘塔罗科血橙’5个品种进行PMFs含量的比较发现，不同品种PMFs提取量不同。U2处理中，PMFs提取量大小的品种顺序为‘沃柑’>‘黄果柑’>‘大雅’>‘春见’>‘血橙’；O3处理中，顺序为‘沃柑’>‘黄果柑’>‘春见’>‘大雅’>‘血橙’；M2处理中的顺序为‘沃柑’>‘黄果柑’>‘春见’>‘大雅’>‘塔罗科血橙’。结果表明3种处理方法中，‘沃柑’PMFs提取量均最高且显著高于‘黄果柑’；‘黄果柑’PMFs提取量次之，且显著高于‘春见’‘大雅’‘沃柑’，这与李利改[25]的研究结果相符合。

3 讨论

由表4可知，不同提取方法对‘黄果柑’果皮中PMFs的提取量的影响不同。超声提取法最优处理为U2组合（提取剂：甲醇；时间：45 min；料液比：1∶20），这与赵梓燕[21]对提取剂、时间和料液比的单因素试验结果相符合；振荡提取法最优处理为O3组合（提取剂：甲醇；时间：3 h；料液比：1∶30），这与聂超[26]对震荡提取的结论相一致；微波提取法最优处理为M2组合（提取剂：甲醇；时间：45 s；料液比：1∶20），这与吕名秀[27]对微波提取法中料液比的单因素试验结论一致。在这3种提取方法中，‘黄果柑’PMFs提取量最高的处理方法是微波提取法M2处理组合，提取量高达(389.559±2.820)µg/100 mg。并且在相同处理条件下，PMFs提取量大小为微波提取法>超声提取法>振荡提取法，这表明微波对PMFs的提取促进效果更强，这也与吕名秀[27]等的研究结果相一致。

由表5可知，其余4个柑橘品种均能提取并检测出目标化合物，且产物含量均在200µg/100 mg以上。PMFs提取量在(195.120～431.651)µg/100 mg之间，这与许引[28]的研究结果相符合，说明3种提取方法有效。

表5 3种处理对5种柑橘PMFs提取量的影响Table 5 Effects of three treatments on PMFs extraction of five kinds of citrus

表5结果说明柑橘品种本身对提取量的影响较大，这也可能与柑橘果实的品质相关[17]。从表5中可以明显看出3种提取方法在不同品种上的提取效果差异很大，其原因可能与柑橘品种果皮本身的特性有关。‘沃柑’品种生长势旺，营养物质积累丰富，且油胞密度大，单位质量的果皮粉末中所含的PMFs百分含量更大，因此在相同处理中，提取量均高于其他品种。‘黄果柑’果树生长势强，挂果时间长又极其丰产，较长的果实发育和保留期在果皮PMFs的积累中也存在一定的影响。由此导致‘黄果柑’果皮PMFs含量较高。

5个品种PMFs提取量在不同组合下并不一致，且在提取量上也存在极大差异，该现象与寇广宁[5]在研究讨论时描述的现象相同，其中‘沃柑’‘大雅’和‘塔罗科血橙’3个品种PMFs提取量大小顺序为U2>M2>O3，‘黄果柑’与‘春见’的PMFs提取量大小顺序均为：M2>U2>O3。这表明相同处理条件下，不同品种对PMFs提取量大小的影响不同。进一步说明了M2处理是针对‘黄果柑’品种PMFs提取的最优处理组合。

4 结论

综上所述，本试验通过研究超声提取法、振荡提取法和微波提取法对‘黄果柑’果皮PMFs提取量的影响，从27种处理中筛选出‘黄果柑’PMFs提取的最优组合为M2组合（提取剂：甲醇；提取时间：45 s；料液比：1∶20）。其次，在相同处理方法（M2）中，PMFs提取量最高的是‘沃柑’，达到(431.651±1.711)µg/100 mg。‘黄果柑’中的PMFs提取量居于第二，‘春见’和‘大雅’间差异不大，‘塔罗科血橙’提取量最小。本试验结果为多甲氧基黄酮的分离检测提供了参考依据。