楝酰胺对肝癌细胞的促凋亡作用及其机制

楚蕾蕾，高国伟，杨桢桢，杨留勤，武莉萍

1 新乡医学院第四临床学院，河南新乡 453000；2 新乡市中心医院放疗科

原发性肝癌是全球第六大常见的癌症，同时也是全球第三大癌症死亡的原因。原发性肝癌是导致全球男性死亡的因素第二位［1］。多数原发性肝癌患者确诊时病情已进展至晚期，预后不良［2］。原发性肝癌的易转移、易复发是导致患者生存率不高的主要原因［3］。分子靶向药物和免疫制剂的研究成为肝癌治疗的热点［4］，进一步研究［5］发现，肿瘤细胞的代谢重编程可能与其耐药性密切相关。在一项动物模型研究［6］中发现，抑制已糖激酶Ⅱ（HK2）表达可减少肝癌细胞的增殖，且对小鼠没有明显不良反应。与人正常肝细胞相比，肝癌细胞过表达HK2，而沉默HK2 表达可不仅癌细胞的凋亡，抑制肝癌的发生发展［7］。楝酰胺（Rocaglamide，Roc-A）是一类从米仔兰植物属中提取的一种抗肿瘤物质［8］，其抗肿瘤活性的报道最早可追溯到1973 年［9］。Roc-A 不仅具有抗炎、保护正常组织免受损伤等作用，还具有特异性抑制肿瘤生长和选择性保护正常细胞的双重作用。Roc-A 可通过抑制热休克因子（HSF1）表达，使硫氧还蛋白互作蛋白（TXNIP）表达增加引起葡萄糖摄取减少来抑制糖酵解；还通过激活MAPK p38 和JNK信号通路及抑制Ras-CRaf-MEK-ERK 信号通路诱导细胞凋亡［10］。近年来已有多项研究深入探讨Roc-A抗肿瘤活性的具体作用机制，但Roc-A 是否通过抑制HK2 表达，促进肝癌细胞的凋亡相关研究较少。2020 年6 月-2021 年8 月，我们观察了加入不同浓度Roc-A 培养的肝癌细胞的凋亡情况，并对其可能作用机制进行探讨，现将结果报告如下。

1 材料与方法

1.1 细胞、试剂及仪器 人肝癌细胞株HepG2 购自赛百慷生物技术股份有限公司；Roc-A 购自Med-ChemExpress 公司（64166）；二甲基亚砜购自北京索莱宝公司（1129E035）；MEM 培养基、PBS 购自美国HyClone 公司；胎牛血清购自澳洲Invigentech 公司；YF488-Annexin V/PI 细胞凋亡试剂盒购自US Everbright Inc；HK2（DF6176）、抑凋亡因子类似物（BCL2L1，AF6139）、β-actin（AF7018）购自Affinity 公司；BCA 蛋白定量试剂盒购自江苏碧云天公司；cDNA合成试剂盒（00983513）购自Takara 公司（00983513）；HK2、BCL2L1 引物序列购自金唯智公司；CO2恒温细胞培养箱、酶标仪、分光光度计、台式高速常温离心机、荧光显微镜购自美国Thermo 公司；Q Exactive 质谱仪、Orbitrap Fusion 质谱仪、Q Exactive HF 质谱仪购自ThermoFisher 公司；化学发光凝胶成像系统购自上海天能科技有限公司；电泳仪、电泳槽购自美国BIO-RAD 公司；PCR 仪购自France公司。

1.2 加入不同浓度Roc-A 培养的HepG2 细胞凋亡情况观察 采用YF488-Annexin V/PI 荧光双染法。取适量HepG2 细胞，置于含10%胎牛血清、1%青链霉素混合液的MEM 培养基中，37 ℃、5%CO2恒温培养箱中培养，隔天换液1 次。当细胞生长至90%左右，胰蛋白酶进行消化传代，按1：3 比例传代培养。取对数生长期HepG2细胞，贴壁培养于6孔板，分为5组，分别加入0（空白对照）、25、50、100、200 nmol/L的Roc-A溶液，培养24 h时取各组细胞，加Annexin V的结合缓冲液、YF488-Annexin V 和PI 的混合液共50 μL，避光孵育30 min，冲洗，加Hochest 20 μL，避光孵育15 min，在合适的荧光下用荧光显微镜观察各组细胞凋亡情况胞。对细胞进行计数，测算各组细胞凋亡率。细胞凋亡率=凋亡细胞数/全部细胞数×100%。实验重复3次，取平均值。

1.3 加入不同浓度Roc-A培养的HepG2细胞HK2、BCL2L1 mRNA 检测 取对数生长期HepG2 细胞，分为2 组，分别加入0（空白对照）、100 nmol/L 的Roc-A 溶液，培养24 h 时取2 组细胞，RT-qPCR 法检测HK2、BCL2L1 mRNA。RNA试剂盒提RNA，cDNA试剂盒反转录，根据试剂盒说明书进行，荧光染料SYBR 进行定量实时PCR，PCR 反应条件：95 ℃5 s，60 ℃30 s，共40 个循环。荧光强度与循环数作图，生成扩增曲线。HK2 引物序列：上游引物5′-GAGCCACCACTCACCCTACT-3′，下游引物5′ -CCAGGCATTCGGCAATGTG-3′。BCL2L1 引物序列：上游引物5′-GTCTTCGCTGCGGAGATCAT-3′，下游引物5′-CATTCCGATATACGCTGGGAC-3′。β-actin 引物序列：上游引物5′-TCTGGCACCACACCTTCTAC-3′，下游引物5′-TCTGGCACCACACCTTCTAC-3′。以2-ΔΔCt（Ct 代表循环阈值）值表示代表HK2、BCL2L1 mRNA的相对表达量。实验重复3次，取平均值。

1.4 加入不同浓度Roc-A培养的HepG2细胞HK2、BCL2L1 蛋白检测 ①取适量HepG2 细胞，分为3组，分别加入0（空白对照）、100、200 nmol/L的Roc-A，培养24 h 提取样品，进行超声裂解、丙酮沉淀、酚抽提，测定蛋白浓度，进行蛋白酶解与TMT 标记，质谱上机与数据处理，采用蛋白组学质谱分析（TMT）法对样品进行LC-MS/MS 分析。用Foldchange 来评估蛋白在样品间的表达水平变化倍数，经t检验计算的P值表现蛋白间差异的显著程度（差异筛选条件：Foldchange≥1.5 倍且P＜0.05），将数据进行统计处理。②采用Western Blotting 法检测HK2、BCL2L1蛋白。取对数生长期HepG2 细胞分为5 组，分别加入0、25、50、100、200 nmol/L 的Roc-A 溶液，培养24 h 时取各组细胞，冰上裂解离心，提取上清蛋白，BCA 法测浓度，取样品50 μg，上样电泳，转PVDF膜，加一抗，4 ℃过夜，TBST 洗膜，加二抗（1∶10 000），显影，用Image J 软件测蛋白的灰度值，以目的条带与β-actin 条带灰度值比值为目的蛋白的相对表达量。实验重复3次，取平均值

1.5 癌组织HK2 表达与肝癌患者的生存时间关系分析 采用Kaplan Meier Plotter 癌症数据库分析癌组织HK2 表达与肝癌患者生存时间的关系。Kaplan Meier Plotter癌症数据库（http：//kmplot.com/analysis），它是对21 种肿瘤（包括乳腺癌、卵巢癌、肺癌及胃癌）超过54 000 个基因（数据类型包括芯片数据、高通量测序数据，涉及mRNA、miRNA、蛋白和DNA）进行生存分析。其数据主要来源于GEO、EGA 和TCGA 数据库，通过Kaplan-Meier 算法分析癌组织HK2 表达水平与肝癌患者预后之间的关系［11］。

1.6 统计学方法 采用SPSS 21.0 软件、Graphpad prism 9.0软件进行统计分析。采用P-P 图检验资料的正态性，成正态分布的计量资料以表示，两组均数间比较采用Dunnett-t检验，多组均数间比较采用单因素方差分析，不符合正态分布的计量资料用［M（P25，P75）］表示，组间比较采用秩和检验；生存曲线用Kaplan-Meier 法绘制，采用Log-ranktest进行统计检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 加入不同浓度Roc-A 培养的HepG2 细胞凋亡率比较 加入0、25、50、100、200 nmol/L 的Roc-A 溶液HepG2 的细胞凋亡率分别为0.83% ± 0.21%、9.46% ± 2.34%、24.68% ± 4.22%、39.60% ±2.16%及58.63%±1.62%，组间两两比较，F=8 807，P＜0.05。

2.2 加入不同浓度Roc-A培养的HepG2细胞HK2、BCL2L1 mRNA相对表达量比较 培养24 h时，加入0、100 nmol/L Roc-A 溶液的HepG2 细胞HK2 mRNA相对表达量分别为1.02 ± 0.02、0.16 ± 0.05（t=63.39，P＜0.05）；BCL2L1 mRNA 相对表达量分别为0.98±0.05、0.17±0.08（t=52.32，P＜0.05）。

2.3 加入不同浓度Roc-A培养的HepG2细胞HK2、BCL2L1 蛋白相对表达量比较 TMT 法检测加入0、100、200 nmol/L Roc-A 的HepG2细胞HK2蛋白相对表 达量 分 别为1.29 ± 0.02、0.79 ± 0.02、0.85 ±0.03，组间两两比较，F=10 932，P＜0.05；BCL2L1 蛋白相对表达量分别为1.49 ± 0.07、0.77 ± 0.06、0.84±0.03，组间两两比较，F=155.3，P＜0.05。

WESTERN Blotting 法检测培养24 h 时加入0、25、50、100、200 nmol/L Roc-A 溶液培养的HepG2 细胞HK2 蛋白相对表达量分别为0.54±0.01、0.51±0.04、0.22 ± 0.01、0.13 ± 0.02、0.15 ± 0.03，组间两两比较，F=3158，P＜0.05。加入0、25、50、100、200 nmol/L Roc-A 溶液培养的HepG2 细胞BCL2L1蛋白相对表达量分别为0.86 ± 0.08、0.75 ± 0.04、0.45±0.03、0.35±0.04、0.30±0.02，组间两两比较，F=266.2，P＜0.05。

2.4 癌组织不同HK2 表达的肝癌患者生存时间比较 在Kaplan Meier Plotter 癌症数据库共筛选3 099个数据。与癌组织HK2 高表达的肝癌患者比较，HK2 低表达的肝癌患者的生存时间更长（P=0.0009）。

3 讨论

1982年第一个生物活性物质Roc-A被学者［12］从Aglaia elliptifolia 中分离出来，并在小鼠白血病模型中被证明能延长生存时间。迄今为止，从30 多种Aglaia 物种中分离出了100 多种天然的环戊烷并苯并呋喃类化合物，其中一类Roc-A 被证明有抗肿瘤活性［13］，可通过将真核翻译起始因子4A（eIF4A）作用于特定的RNA 序列之间的双分子腔来发挥作用［8］。Roc-A不仅可以抑制癌细胞的增殖，也能促进癌细胞的凋亡［14-15］。除抗癌活性外，Roc-A 还能保护原代细胞免受化疗诱导的细胞死亡，减轻神经元组织的炎症和药物诱导的损伤［10］。除此之外研究［16］还发现，Roc-A可选择性调节癌细胞的能量代谢。

目前癌症能量代谢成为抗肿瘤机制研究的热点，肿瘤细胞的能量代谢重编程还与化疗耐药密切相关［17］，并且能量代谢过程中关键酶的变化影响糖酵解过程和乳酸的产生，导致肿瘤耐药性产生，进而促进肿瘤细胞生长转移［18］。而肝癌细胞可能是能量代谢重编程最全面的细胞［19］。最早发现的有氧糖酵解，主要参与肝癌的增殖、免疫逃逸、侵袭、转移、血管生成和耐药性的调控［20］。已糖激酶作为糖酵解的第一个限速酶，有四种亚型（HK1、HK2、HK3 和HK4），HK2 在肝癌组织中高表达，与病理分期和预后直接相关［21］。HK2 的过表达在许多类型的癌症中一直被报道，如促进乳腺癌［22］、胰腺癌［23］等肿瘤细胞的生长、增殖和转移。我们通过分析KM-Plotter的数据，发现肝癌患者中HK2 的表达与总生存时间有关，且HK2 表达水平越高的患者生存时间越短，因此HK2 的表达水平可能与其预后不良相关。抑制HK2的表达，使HK2和电压依赖型阴离子通道蛋白1（VDAC-1）之间的相互作用被破坏，促凋亡蛋白Bax可以更有效地与细胞膜上的VDAC-1结合，细胞膜通透性增加，细胞色素C释放增加，从而诱导细胞凋亡［24］。张宇等［25］发现，沉默HK2 表达可显著降低HepG2 细胞增殖活性，显著升高HepG2 细胞凋亡率。分化差的肝癌细胞HLE 中HK2低表达，HLE 细胞依赖谷氨酰胺进行三羧酸循环，而分化良好的肝癌细胞HUH7 中HK2 高表达，这种细胞依赖葡萄糖和谷氨酰胺进行三羧酸循环进行能量代谢［26］。这说明不同分化程度的肝癌细胞代谢方式有所不同。

最新研究［27］发现，手术切除的肝癌组织标本中HK2 的表达明显高于邻近组织、正常组织，HK2 高表达与肝癌患者的预后不良具有显著相关性。过表达HK2 促进乳糖代谢，细胞迁移侵犯，而敲除HK2基因完全相反，说明HK2 促进肝癌细胞的糖酵解，促进肝癌细胞的侵犯、转移等。HK2 siRNA 转染HepG2和Hep3B能显著下调肝癌细胞葡萄糖和乳酸的消耗量，用雷帕霉素（mTOR 抑制剂）处理HepG2和Hep3B 能显著下调HK2 mRNA 和HK2 蛋白以及葡萄糖和乳酸的消耗。这些结果提示mTORSTAT3-HK2 通路参与调节肝癌细胞的糖酵解，这使得我们有可能通过干预肝癌细胞的糖酵解来治疗肝癌患者［28］。核糖体RNA 加工蛋白15（RRP15）在肝癌细胞中明显高表达，与预后不良显著相关，基因敲除RRP15能抑制HCC 增殖，体内实验和体外实验均能证明这一点。

研究［29］发现RRP15 敲除使得肝癌细胞Hep3B细胞通过HK2 途径改变能量摄取方式：未敲除基因的戊糖磷酸化变为敲除后的正常的线粒体氧化磷酸化，这一变化导致凋亡的发生。其他研究结果进一步验证相比正常细胞和组织，肝癌肿瘤组织和细胞HK2 高表达，用黄岑纯化物药物处理下调HK2 表达，能下降葡萄糖摄取能力，使得Bax 从细胞胞浆释放入线粒体中，从而导致肝癌细胞凋亡。肝癌组织小鼠体内移植实验也证明这一点［30］。金雀异黄酮处理肝癌细胞研究［31］结果同上，金雀异黄酮抑制糖酵解诱导肝癌细胞线粒体凋亡。有氧糖酵解促进肝癌细胞转移并和预后不良密切相关，HK2 是有氧糖酵解的关键组成。组成型光形态建成信号传导复合体9（COP9）信号体复合体的第五组分（COPS5/CSN5）。沉默表达CSN5导致HK2蛋白明显减少，抑制HK2 表达能抵消CSN5 的糖酵解作用。通过实验发现HK2是糖酵解的关键，控制HK2的表达就能控制肝癌细胞的侵袭、转移和凋亡［32］。穗花杉双黄酮具有抗肿瘤活性，而对正常细胞的活性没有明显影响。体内体外实验［33］发现穗花杉双黄酮能诱导肝癌细胞凋亡，同时研究发现穗花杉双黄酮能通过下调HK2 来抑制肝癌细胞糖酵解。这两者具有相关性。进一步研究发现穗花杉双黄酮通过ROS，抑制JAK2/STAT3通路来下调HK2的表达。

HK2 是糖酵解的关键，多种药物和生物技术手段能通过下调HK2 的表达来发挥抗肿瘤活性，抑制肝癌细胞的转移侵袭，促进肝癌细胞的凋亡。而我们的实验发现Roc-A 通过抑制糖酵解的过程并促进肝癌细胞的凋亡，并呈浓度依赖性，且证实HK2 的表达下降、BCL2L1 的表达下降。因此，我们推测，HK2 在线粒体上的减少，Bax 更容易获得VDAC-1，VDAC-Bax 复合物的形成能通过细胞色素C 等促凋亡蛋白，从而诱导细胞凋亡。抑制HK2 表达时，促进Bax 与VDAC 的结合，细胞凋亡明显增加。而肿瘤细胞中HK2 表达的调控是多样的，与糖酵解途径中的其他酶一样，HK2 的表达主要受c-myc、HIF-1α和p53 的调控［34］。此外，miR-143、miR-155、miR-218和lincRNA-RoR 等microRNAs 被证明能够调节HK2的表达［35-38］。SANTAGA 等［39］发现Roc-A 是HSF1 激活的最强抑制剂。本研究结果发现，HK2 的减少伴随着癌细胞凋亡的增加，而HK2 的减少对楝酰胺在肝癌中发挥抗肿瘤活性起着关键作用，但楝酰胺影响HK2表达的确切机制仍需进一步研究。

综上所述，加入Roc-A 培养可促进肝癌细胞的凋亡，并且细胞凋亡与Roc-A 溶液浓度呈正相关，细胞HK2、BCL2L1 mRNA 及蛋白表达均降低。Roc-A可能通过抑制BCL2L1 mRNA 及蛋白表达，增加肝癌细胞的膜通透性，抑制抗凋亡蛋白表达，促进肝癌细胞的凋亡。但本研究仅Roc-A 促进肝癌细胞凋亡的相关机制进行了初步探讨，详细的分子机制尚有待进一步研究。