EBV相关胃癌发病机制的研究进展

张妙心，周琦

华中科技大学同济医学院附属同济医院消化内科，武汉430030

Epstein-Barr病毒(EBV)是第一个被发现与人类肿瘤相关的DNA病毒。据估计，EBV相关肿瘤每年新发病例约200 000例，每年死亡病例约占全部恶性肿瘤死亡病例的1.8%[1]。EBV可导致多种细胞来源的肿瘤，包括B细胞来源的Burkitt淋巴瘤、经典霍奇金淋巴瘤、B细胞淋巴瘤等，NK/T细胞来源的鼻型NK/T细胞淋巴瘤，上皮细胞来源的鼻咽癌、胃腺癌以及间叶细胞来源的平滑肌肉瘤[2]。EBV相关胃癌(EBVaGC)约占所有胃癌总数的8.7%[3]。自1990年有学者首次在胃癌组织中检测到EBV后，EBV在胃癌发病机制中的作用逐渐受到重视。EBVaGC是一种具有独特临床病理特征的胃癌亚型，好发于男性，近端胃或残胃多见，但其淋巴结转移率较低，预后相对较好[4-5]。近年来，越来越多研究关注到EBVaGC的发病机制。本文结合文献就EBVaGC发病机制的研究进展作一综述。

1 EBVaGC发生的始动因素

EBV感染在全球范围内普遍存在，90%以上的成人EBV相关抗体呈阳性[2]。EBV主要通过唾液传播，首次感染后在口咽部上皮细胞内大量复制，随着脱落的上皮细胞释放病毒颗粒，感染B细胞及其他细胞，诱导机体免疫应答，激活NK细胞，产生EBV特异性CD8+细胞毒性T细胞，抑制EBV感染的B细胞增殖，最终清除EBV感染的B细胞，仅于部分记忆B细胞内持续存在甚至终身潜伏感染[4]。

EBV感染B细胞的过程十分高效，而在CD21阴性的胃黏膜上皮细胞中直接感染的概率很低。因此，EBV感染胃黏膜上皮细胞主要依赖胃内感染EBV的记忆B细胞与胃黏膜上皮细胞的直接接触，其过程大体可分为三个阶段：首先，CD21介导的EBV与B细胞整联蛋白的共成帽反应激活黏连蛋白；其次，EBV感染的记忆B细胞通过黏连蛋白与上皮细胞形成偶联；最后，细胞融合以及病毒颗粒摄入[6]。

尽管90%以上的成年人为EBV携带者，但EBV感染极少见于非肿瘤胃黏膜上皮细胞，而几乎所有肿瘤细胞中可检测到单克隆EBV，提示EBV感染建立于胃癌发生的早期阶段[2]。因此，EBVaGC可能是在伴有癌前状态基因变异的上皮细胞中建立异常EBV潜伏感染导致的。

EBV感染后基因表达模式包括Latency Ⅰ～Ⅲ。Latency Ⅰ主要表达核抗原EBNA1、非编码RNA EBERs及miRNAs(以miR-BARTs为主)；Latency Ⅱ主要表达EBNA1、LMP1、LMP2A/2B、EBERs及miR-BARTs；LatencyⅢ表达所有潜伏基因。EBV是第一个被发现可编码miRNAs的人类病毒[2]。在EBVaGC中，EBV潜伏感染模式为Latency Ⅰ或介于Latency Ⅰ与Latency Ⅱ，其潜伏基因产物包括EBERs、EBNA1、miR-BARTs，不表达或低表达LMP1、LMP2B[7]。此外，EBV还可引起宿主细胞DNA甲基化，导致宿主细胞基因异常表达和细胞信号通路失衡，从而诱导EBVaGC的发生[8]。

2 潜伏基因产物在EBVaGC发生中的作用

2.1 EBERs EBERs属于EBV转录的非编码RNA，包括EBER1、EBER2。尽管在EBVaGC中EBERs表达丰富，但目前其在肿瘤发生中的作用仍不明确。IWAKIRI等[9]研究发现，EBERs能够上调胰岛素样生长因子1表达，促进EBV阴性胃癌细胞增殖。EBERs还可激活IL-6/STAT3信号通路，使肿瘤细胞更易发生耐药和迁移[10]。

2.2 EBNA1 EBNA1对于EBV潜伏感染的建立具有重要作用。在宿主细胞中，EBNA1与EBV DNA结合，可稳定EBV基因组，使EBV基因组以游离环状DNA分子的形式持续存在，从而维持EBV潜伏感染状态。在胃癌细胞中，EBNA1可引起活性氧自由基累积，从而增强肿瘤细胞活性[11]；EBNA1还可通过DNA甲基化抑制胃癌特异性抑制基因GKN1、GKN2表达[12]。因此，通过抑制EBNA1表达，避免EBV稳定感染建立，有可能成为EBVaGC的治疗策略之一。

2.3 LMP2A LMP2A在EBVaGC特征性DNA甲基化过程中具有重要作用。胞嘧啶甲基化反应由DNA甲基转移酶完成。LMP2A可通过引起STAT3磷酸化诱导DNMT1过表达，继而引起抑癌基因PTEN启动子甲基化[13]。LMP2A还可诱导ERK磷酸化，激活DNMT3a转录，引起AQP3启动子甲基化并下调AQP3表达，促进肿瘤的发生、发展[14]。此外，LMP2A还能抑制TET2表达，削弱其对DNA甲基化的防御作用[15]。

miR-200表达下调是EBVaGC发生的重要机制之一。LMP2A可抑制miR-200表达，使其靶点CDH1的转录抑制物ZEB1、ZEB2表达增加，CDH1表达丢失，其所编码的E-cadherin表达下调，继而引起肿瘤转移。此外，BRAF0、EBNA1、EBERs对miR-200表达亦具有一定抑制作用[16]。但EBV感染能否导致宿主miRNAs表达下调仍需更多证据。

YASUI等[17]研究发现，在EBVaGC细胞系中，LMP2A可激活NF-κB-Survivin信号通路，上调Survivin表达从而起到抗细胞凋亡作用。胃癌细胞核内NF-κB信号激活还可提高miR-155-5p表达，从而下调Smad2、p-Smad2表达，后者在转化生长因子β转录中具有重要作用[18]。QI等[19]研究发现，LMP2A、LMP1过表达可使TRAF2水平降低，从而抑制COX-2表达，而p-ERK可协助LMP1发挥抑制COX-2表达的作用。此外，LMP2A还能影响其他肿瘤相关基因表达，如抑制HLA表达和上调FOXO1、FOXO3表达[20]。由此可见，LMP2A能够通过影响多个信号通路，激活甲基化反应，导致癌基因或抑癌基因异常表达，从而促进EBVaGC的发生、发展。

2.4 miR-BARTs 所有EBV感染的宿主细胞存在miR-BARTs表达。在EBVaGC组织中，已明确有40种成熟miR-BARTs表达。既往研究着重于miRNAs在鼻咽癌中的作用，近年来探索miR-BARTs在EBVaGC发生中作用的研究逐渐增多。SHINOZAKI-USHIKU等[21]研究发现，miR-BART4-5p可下调EBV阳性胃癌细胞Bid表达，从而起到抗细胞凋亡作用。ZHENG等[22]研究表明，miR-BART5-3p可直接靶向抑制抑癌基因TP53，下调细胞周期抑制物p21表达，从而使宿主细胞不易凋亡，继而促进肿瘤发生。miR-BART3-3p具有相似的作用，可通过调节SASP表达抑制肿瘤组织NK细胞和巨噬细胞浸润，协助胃癌细胞免疫逃逸[23]。miR-BART11可抑制FOXP1表达，促进上皮间质转化，从而增强肿瘤细胞的侵袭能力[24]。miR-BART10-3p和miR-BART22可激活Wnt信号通路，促进肿瘤细胞迁移[25]。miR-BART17-5p能够通过调节KLF2表达，促进肿瘤细胞非贴壁生长和迁移。在鼻咽癌细胞中，miR-BART7-3p可抑制SMAD7表达，而SMAD7表达变化与肿瘤细胞迁移和耐药性密切相关[26]，但在EBVaGC细胞中鲜见此类报道。部分miR-BARTs可下调凋亡前蛋白表达，从而起到抑制细胞凋亡作用[8]。

BARF1通常在溶解性感染中表达，但在EBVaGC中亦可检测到表达。在胃癌细胞中，BARF1可上调Bcl-2表达、抑制Bax表达，使肿瘤细胞可以抵抗化疗药物引起的细胞凋亡；BARF1可激活NF-κB-Cyclin D1信号通路，促进胃癌细胞增殖并抑制p21表达[27]。

在EBVaGC细胞系中，部分外泌体中富含miR-BARTs，但仅部分释放至细胞内，以miR-BART15-5p为主。miR-BART15-5p能够通过调节NLRP3表达而抑制炎症反应，促进肿瘤生长；同时，miR-BART15-5p能够靶向抑制抗凋亡蛋白BRUCE、TAX1BP1表达，诱导细胞凋亡[28]。因此，miR-BART15-5p可通过外泌体释放，引起肿瘤细胞和周围免疫细胞凋亡。但外泌体在EBVaGC发生中的作用仍需进一步研究。

EBV miRNAs不仅能够影响宿主基因表达，还能下调自身潜伏基因表达，干扰抗原提呈和免疫细胞激活，从而实现免疫逃逸[29]。

3 DNA甲基化在EBVaGC发生中的作用

EBVaGC的主要分子异常表现为非随机CpG岛甲基化表型[5]。KANEDA等[30]研究发现，在低甲基化胃癌细胞系中EBV感染可在18周内导致其新发甲基化，使其转化为EBV阳性极高的甲基化细胞系并抑制多种抑癌基因表达。EBV还可影响细胞周期相关基因和细胞分化相关基因表达[31]。

LIANG等[32]在EBVaGC细胞中共发现216种基因由于甲基化而表达受抑。ZHAO等[33]研究明确了EBV阳性AGS细胞系中886种与肿瘤发生相关的基因，并且其启动子均发生甲基化。其中，PIK3CA和ARID1A基因启动子甲基化比例最高。约80% EBVaGC细胞可见PIK3CA基因变异，而在其他胃癌亚型中仅为3%～42%[5]。ARID1A基因变异在EBVaGC细胞中的发生率约为55%，该基因表达受抑可导致E-cadherin表达下调，从而促进肿瘤细胞的侵袭和迁移。在非瘤变的胃黏膜细胞中亦可见到ARID1A基因变异，提示此类细胞有可能是EBVaGC发生的先驱细胞[34]。EBV相关肿瘤均存在CDKN2A启动子甲基化表达，其表达可导致抑癌基因p16表达缺失[30]。此外，在EBVaGC细胞中缺乏MLH1甲基化表达，这是区分EBVaGC与微卫星不稳定型胃癌的重要依据[5]。

除了上述代表性基因变异外，在EBVaGC中与减数分裂相关的抑癌基因Rec8启动子甲基化水平高于其他无EBV感染的胃癌亚型，并且其启动子甲基化水平与患者预后密切相关[35]。ZHAO等[36]研究发现，在EBVaGC细胞中SSTR1基因可出现甲基化，SSTR1基因有可能是一种潜在的抑癌基因。5-氮杂胞嘧啶具有DNA去甲基化作用。SCHINEIDER等[37]研究发现，化疗前使用5-氮杂胞嘧啶可重新激活抑癌基因，增强化疗效果，提示去甲基化可能在EBVaGC治疗中发挥重要作用。

除了宿主细胞DNA甲基化外，EBV病毒DNA亦可发生甲基化，以逃避免疫识别和应答，维持潜伏感染状态。MATSUSAKA等[31]研究发现，病毒DNA甲基化通常于感染后17天完成，而潜伏基因表达产物可在感染后10天被检测到。由此推测，病毒DNA甲基化始于潜伏基因表达之后。

4 免疫逃逸在EBVaGC发生中的作用

约15% EBVaGC可见CD274和PDCD1LG2表达增加。CD274和PDCD1LG2分别编码PD-L1、PD-L2，二者均为免疫抑制蛋白，可抑制T细胞激活[5]。由此推测，CD274和PDCD1LG2在EBVaGC免疫逃逸中具有重要作用。目前，以PD-1/PD-L1为靶点的免疫治疗已进行了多项临床试验，疗效显著，可能对EBVaGC治疗有效。

EBVaGC具有特征性微环境，如聚集大量CD8+T细胞、低密度CD204和M2型肿瘤相关巨噬细胞，还存在少量具有抗肿瘤作用的CD66b+中性粒细胞。然而，EBVaGC细胞可表达大量吲哚胺2，3-双加氧酶，可造成T细胞合成代谢所必需的色氨酸耗竭[38]。此外，EBV还可产生CCL22，使肿瘤部位聚集Foxp3+调节性T细胞，抑制CD8+T细胞的抗肿瘤作用。ABE等[39]研究发现，在固有免疫中CD47“do not eat me”信号在24% EBVaGC中表达，并伴有CD8∶Foxp3减小，提示在EBVaGC中CD47可通过封锁适应性免疫来发挥作用。

综上所述，EBV在伴有癌前状态的胃黏膜上皮细胞内建立异常潜伏感染，诱导肿瘤微环境逃避免疫清除，并通过潜伏基因产物引起宿主DNA甲基化，导致相关基因异常表达，从而引起EBVaGC发生。