骨性关节炎关节软骨细胞凋亡的研究进展

左显锋，范建楠,，莫愁，罗嘉熠

1贵州医科大学临床医学院，贵阳550004；2贵州医科大学附属医院骨科

上世纪九十年代，国际骨性关节炎专题会议对骨性关节炎作出重新定义，骨性关节炎是指在力学和生物学因素的共同作用下，导致软骨细胞、细胞外基质及软骨下骨三者降解和合成正常偶联失衡的结果[1]。骨性关节炎的病理特征为关节软骨局灶性缺如、骨赘形成、软骨下骨改变及关节滑膜增生，其中，软骨的异常改变是当今研究的主要方向，不过目前对于该病的发病机制以及主要病因暂时没有明确的报道[2]。软骨细胞的主要功能是将机体软骨的完整程度进行良好维持，并使关节软骨能够获得充分的负重能力[3]。关节软骨细胞凋亡在骨性关节炎患者的病程进展中扮演重要角色，其与多条信号转导通路有着紧密的联系。现从骨性关节炎关节软骨细胞凋亡的基本概念、特征、诱发因素、凋亡途径及其调节等方面进行综述。

1 骨性关节炎关节软骨细胞凋亡的基本概述

有学者在1972年首次对细胞凋亡进行描述，发现细胞凋亡和细胞坏死的死亡方式有一定的区别，前者被称为程序性细胞死亡[4]。研究认为，在细胞中事先就存在导致细胞凋亡的程序，在程序没有被触发时细胞表现正常，若程序在各种因素影响下被触发，则细胞凋亡随即开始。相关研究报道显示，在骨性关节炎关节软骨中存在着软骨细胞的过度凋亡情况[5]。采用荧光激活细胞分类法对人类正常关节软骨及骨性关节炎关节软骨进行观察发现：人类正常关节软骨细胞凋亡占比约为5%，而骨性关节炎关节软骨细胞存在20%左右的凋亡现象。在对家兔模型进行研究对比时也发现了同样现象，骨性关节炎模型对象的软骨细胞凋亡数量及占比显著增加，约为正常关节软骨的5倍[6]。虽然现存理论说明了关节软骨细胞凋亡与骨性关节炎之间有关联性，但难以确定关节软骨细胞凋亡的根本原理及机制。多数观点认为以下几个环节可能对关节软骨细胞凋亡产生影响，即：体内信号传递系统、诱导因子、细胞内调节诱导因子以及蛋白水解链式反应等[7]。Fas配体、肿瘤坏死因子等软骨细胞凋亡诱导因子与细胞表面的相应受体相结合，结合后对早期信号传递分子进行聚集，链式反应酶系统从而被激活，在依次激活的过程中，不断放大死亡信号，促进细胞凋亡进程[8]。

2 骨性关节炎关节软骨细胞凋亡的特征

对骨性关节炎患者的关节软骨进行连续切片观察发现，软骨细胞的凋亡表现为病灶性，而非散在分布[9]。患者软骨表面会受到细胞核固缩以及细胞破损的影响而出现数量较多的腔隙，且形态与基质小泡样及溶酶体空腔隙类似。骨性关节炎患者的关节软骨中层以及表层为出现关节软骨细胞凋亡的主要位置。虽然正常关节软骨细胞也会出现凋亡，但大多位于表层，而且不会轻易被检出[10]。

3 骨性关节炎关节软骨细胞凋亡的诱发因素

3.1 生物化学因素 常见的生物化学因素主要包括药物、毒素及重金属等，这些因素均能使机体关节软骨受到程度不一的影响[11]。例如，硝普钠作为一氧化氮供体中的一种，会通过生产外源性一氧化氮，进而引起软骨细胞产生凋亡现象，最终诱导产生疾病。再如，T-2毒素的毒性较强，极小的剂量即可对体外培养的大鼠关节软骨细胞造成损伤，主要表现为促进软骨细胞的凋亡及变性，抑制软骨细胞的增殖[12]。

3.2 物理因素 该因素在所有诱发因素中占据了较高的比重，占据着主导地位。常见的物理因素有紫外线辐射、热休克和机械力学作用等[13]，上述因素均会致使患者软骨细胞产生凋亡。对于机械外力影响因素来讲，机体还会受到组织被动作用时间长短及外力大小变化等因素的影响，调节软骨细胞发生凋亡的程度[14]。

3.3 年龄 长期以来，骨性关节炎被认为是一种退行性疾病。观察表明，骨性关节炎的发病机制是多方面的，老龄化是其发展的关键因素。随年龄增大，关节也会呈现出程度不同的劳损问题，继而导致关节软骨退变、细胞凋亡逐步加重，引发原发性骨性关节炎[15]。

3.4 氧化应激 作为一种生物活性因子，活性氧簇可在机体病理状态或一些生理状态下产生[16]。过氧化氢产生后，一方面对细胞脂质进行过氧化，另一方面可以调节其凋亡相关的基因，从而对机体软骨细胞的增殖形成抑制，同时促进软骨细胞凋亡，最终破坏软骨组织[17]。

4 骨性关节炎关节软骨细胞凋亡的途径

骨性关节炎关节软骨细胞凋亡主要包括两种途径[18]，一种为一氧化氮途径，另一种为Fas途径。

4.1 一氧化氮途径 一氧化氮属于细胞毒性物质的一种，最早发现于上世纪八十年代。一氧化氮具有高度弥散性以及反应性，广泛存在于生物体中，可以形成无机小分子，继而产生较强的杀伤效果[19]。一氧化氮主要通过以下两种途径对骨性关节炎患者产生关节软骨损伤作用。其一，一氧化氮在高浓度状态下，可以对柠檬酸循环、线粒体电荷传递系统产生的酶进行抑制；其二，超氧化阴离子与一氧化氮作用后可产生过氧化亚硝基阴离子，最终形成具有较强毒性的自由基[20-21]。此外，还有一些临床研究发现，外源性或内源性一氧化氮都会以线粒体途径作为介导，对患者机体的关节软骨细胞凋亡进行诱导。软骨细胞在通过一氧化氮、内源性供体磷酸酯、活性氧及细胞色素C等因子干预后，其Caspases-3活性升高、DNA裂解加快，促进了细胞凋亡的进程[22]。研究显示，在临床中治疗骨性关节炎时，将L-单甲基精氨酸作为一氧化氮合酶抑制剂使用，可以使患者的一氧化氮等细胞凋亡标志物表达降低[23]。可见，在骨性关节炎软骨细胞的凋亡途径中，一氧化氮途径可能是诱导其凋亡的重要途径之一。

4.2 Fas途径 Fas属于I型跨膜糖蛋白，位于细胞膜上，也被叫做Apo-1或者CD95，是肿瘤坏死因子或神经生长因子受体中的一种。在人类软骨细胞中，Fas基因主要分布排列在第10号染色体。Fas途径是一条公认的细胞程序性死亡信号传导途径，且在很多细胞中都存在Fas表达[24]。Fas配体(FasL)是一种Ⅱ型跨膜糖蛋白,属于肿瘤坏死因子家族成员,在外周淋巴组织中表达,并可在T细胞激活过程中被诱导表达。FasL与Fas结合，会诱导出酪氨酸与丝氨酸/苏氨的酸磷酸化反应，使细胞中钙离子水平升高、细胞Caspases-3活性升高、DNA裂解加快，促使软骨细胞凋亡[25]。体外研究还发现，Fas及FasL的表达还受细胞密度的调节，低密度区细胞不仅Fas表达较高密度区细胞高，且Fas的激活也是高密度区细胞的1.5倍[26]。

5 骨性关节炎关节软骨细胞凋亡的相关癌基因表达

5.1 c-myc 该基因在人体主要分布在第8号染色体，共包括3个外显子，其蛋白质由439个氨基酸组成，主要在细胞核内存在。软骨细胞处于正常状态时，其细胞核中并没有c-myc的表达，但处于凋亡状态时，其细胞核中便会出现c-myc的阳性表达[27]。有学者采用免疫组化、电镜以及ELISA等将骨性关节炎与正常人的关节软骨细胞进行比较发现，软骨退变与其细胞凋亡程度呈正相关，并且c-myc参与软骨细胞的整个凋亡过程[28]。软骨细胞因c-myc产生凋亡的主要原因是正常细胞周期失去了本该拥有的平衡状态。

5.2 Bcl-2 该基因属于一种原癌基因，被发现于滤泡性淋巴瘤细胞的染色体易位处，能抑制细胞凋亡，对细胞寿命有一定的延长作用。Bcl-2在机体中过表达会对Fas介导的细胞凋亡产生一定的抑制作用[29]。有学者对健康成年人及骨性关节炎患者关节软骨细胞中Bcl-2的表达进行研究发现，骨性关节炎患者软骨细胞中Bcl-2 mRNA的表达低于健康成年人[30]。这间接反映了机体对于细胞凋亡的自我调控，即可合理上调Bcl-2表达状态，来促成对软骨细胞的保护，进一步避免其出现凋亡的情况。另有研究发现，缺乏Ⅱ型胶原的转基因鼠软骨细胞呈现出明显的过凋亡状态，同时其Bcl-2表达降低[31-32]。以上研究表明，细胞中Bcl-2表达与骨性关节炎关节软骨细胞凋亡呈负相关。其他凋亡抑制因子是否参与其中，在Bcl-2家族中是否存在对关节软骨细胞凋亡产生影响的其他成员，这些问题暂无明确定论，还需进一步探究。

5.3 p53 该基因主要分布于细胞核内，分为突变型及野生型。p53基因在健康关节软骨细胞中表达阴性，但在病态关节软骨细胞中表达阳性[33]。在机体细胞中，p53是重要的调节因子，能够提供诱导细胞凋亡及限制细胞生长的信号，且属于关键信号。有动物研究发现，膝骨性关节炎兔较正常兔p53 mRNA水平以及细胞凋亡数量高，表明p53在促使关节软骨细胞凋亡中意义重大[34]。p53导致细胞凋亡的作用机制主要包括两个方面：一方面，p53可以对细胞周期进行调节，致使细胞凋亡；另一方面，p53可以通过间接或直接的方式对细胞DNA的复制过程加以抑制。

6 核因子κB(NF-κB)信号通路在骨性关节炎关节软骨细胞凋亡中的调节作用

NF-κB是1986年发现的一种转录因子，属于一种蛋白质复合物，特异性结合免疫球蛋白κ轻链基因的增强子区域。它最初被认为是B细胞分化和行使功能的调节因子，但后来被发现是各种细胞中普遍存在的转录因子[35]。NF-κB家族包括p65(RelA)、c-Rel、RelB、NF-κB1(p105/p50)和NF-κB2(p100/p52)，它们能两两结合形成同二聚体和各种异二聚体。其中，p65/p50异源二聚体最常见。NF-κB信号途径的激活分为两类，即“经典”和“替代”途径。经典的NF-κB途径由IKKβ调节，IKKβ由炎症细胞因子如TNF-α、IL-1β或LPS激活；而选择性NF-κB途径则由一组TNFR超家族成员激活，包括CD40、淋巴毒素-β受体(LTβR)和NF-κB受体激活剂(RANK)[36]。

miRNA被认为是新的炎症调节因子，其中miR-93因其在凋亡和炎症抑制方面的作用而备受关注。miR-93高表达可以增强细胞活力、抑制细胞凋亡并减弱炎症反应[37]，miR-93靶向NF-κB p50亚单位促进软骨细胞存活及生长。TLR4是NF-κB信号通路的重要调节因子[38]，被确定为软骨细胞中miR-93的直接靶点，并受miR-93负调控。该受体是病原体识别受体之一，因其具有识别骨性关节炎中微生物或宿主衍生配体的能力而在骨性关节炎中受到关注。NF-κB在炎症损伤的诱导中起关键作用。在脂多糖(LPS)的刺激下，NF-κB从IκB分离并转运至细胞核并调节炎性细胞因子的表达，从而导致关节软骨细胞的凋亡和破坏，最终导致骨性关节炎的发生和进展。研究发现，miR-93过表达在体外和体内显著抑制LPS诱导的NF-κB活化[39]。综合表明，miR-93通过抑制TLR4/NF-κB信号通路抑制LPS诱导的炎症反应和软骨细胞凋亡。

NF-κB在软骨细胞存活和凋亡中具有双相作用。NF-κB可防止TNF-α诱导的细胞凋亡，这种作用与诱导抗凋亡基因有关[40]。在软骨细胞中，TNF-α诱导的凋亡也因NF-κB抑制而减少，NF-κB亚单位p65的Nkx3.2依赖性激活可增强ATDC5细胞的软骨细胞存活并减少凋亡。同时，NF-κB也具有促凋亡功能。一些激活NF-κB的因子，如TCF4、SAM68和RIPK1，被发现可增强软骨细胞的凋亡。此外[41]，NF-κB靶基因HIF-2α可加速Fas介导的骨性关节炎软骨细胞凋亡。

NF-κB可以直接或者间接诱导基质金属蛋白酶和其他骨性关节炎相关因子的表达，从而协调异常的软骨细胞分解代谢途径[42]。了解NF-κB激活在软骨分解代谢途径中的分子机制，可能会发现骨性关节炎的一些潜在治疗靶点。

7 总结

目前，骨性关节炎有着年轻化发展的趋势。生化、物理及年龄等均是骨性关节炎关节软骨细胞凋亡的诱发因素；导致软骨细胞出现凋亡的途径主要包括一氧化氮和Fas途径，也与c-myc、Bcl-2及p53等相关癌基因的表达有关；NF-κB信号通路与新识别的基因或通路之间的相互作用也与软骨细胞凋亡存在着内在联系。这些为临床治疗骨性关节炎提供了一定的理论支持。