基于唾液检测病毒感染性生物标志物的研究进展

余舒星 邹静 李雨庆

1.口腔疾病研究国家重点实验室 国家口腔疾病临床医学研究中心四川大学华西口腔医学院 成都 610041；2.口腔疾病研究国家重点实验室 国家口腔疾病临床医学研究中心四川大学华西口腔医院儿童口腔科 成都 610041

口腔中各大小腺体分泌的唾液具备缓冲、润湿、清洁、消化和抑菌等多种功能。唾液中除了常见的有机物及无机物外，随着机体健康状态的变化（如病毒、细菌、真菌等感染），唾液成分也可发生相应的改变。由于唾液成分的动态变化、获得唾液样本的便捷性，加上相关检测技术（包括微生物组学、唾液基因组学、蛋白组学、代谢组学等）的快速发展，使得唾液样本在病毒感染的诊断中具有重要的参考价值[1]。虽然唾液样本相比于血液样本的灵敏度和特异性较低，在常规临床诊疗中也尚未广泛应用，但唾液具有便于采集和取样无创等优势。因此，唾液样本有望作为常规体检筛查手段之一，协助识别病毒感染的高危人群，做到早预防、早治疗[2-4]。

本文将基于唾液样本检测病毒感染性生物标志物的研究进展进行综述。

1 疱疹病毒（herpesviruses）

含包膜的疱疹病毒为双链DNA病毒，属于疱疹病毒科，有8种类型可致病。

1.1 巨细胞病毒（cytomegalovirus，CMV）

CMV为DNA病毒，亦称细胞包涵体病毒，属疱疹病毒组。新生儿感染CMV可造成患儿智力和听力下降，极大影响患儿的生长发育。目前，感染CMV的新生儿约占新生儿总数的0.2%～2%[5-6]。先天感染CMV新生儿的及时识别有助于疾病的早期干预和抗病毒治疗。Boppana等[7]通过实时定量荧光聚合酶链式反应（quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR） 在先天感染CMV新生儿的唾液中，检测出该病毒的特异性和灵敏度可高达99.9%和100%。研究[8]发现：唾液样本与尿液样本的检测结果一致性高达91%。唾液样本具有随时采集的优点，且对于新生儿来说，唾液取样易于操作。但唾液采集时易被同样感染CMV母亲的乳汁、以及分娩时母亲的其他分泌物污染。因此，所有唾液检测阳性的结果仍需进一步验证[9-11]。未来可探索如何使唾液样本的采集避免上述问题的发生，以降低假阳性率[12]。

1.2 EB病毒（epstein-barr virus）

EB病毒属γ疱疹病毒亚科，是一种含包膜的DNA病毒，大部分通过侵袭B淋巴细胞和上皮细胞感染机体[13]。研究[14-15]表明：EB病毒通过感染B淋巴细胞得以长时间生存，而口腔上皮细胞感染可使EB病毒分泌到唾液中。研究发现：EB病毒与鼻咽癌的发生密切相关。鼻咽癌患者体内通常存在较高水平的EB病毒特异性抗体。相比于正常健康体检者的唾液而言，以酶联免疫吸附法（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）法检测EB病毒感染的鼻咽癌患者的唾液后发现：其病毒抗原免疫球蛋白A（virus antigen immunoglobulin A，VCA/IgA）和病毒早期抗原免疫球蛋白A（viral early antigen immunoglobulin A，EA/IgA）抗体的平均水平显著升高。因此，唾液中EB病毒特异性抗体VCA/IgA以及EA/IgA的检出水平对鼻咽癌有较高的诊断价值[16]。对于免疫力低下者，如伴有获得性免疫缺陷综合征（acquired immune deficiency syndrome，AIDS）或肾脏移植后的患者，其唾液中EB病毒载量明显高于普通感染者[17-19]。唾液样本不仅可用于检测该病毒及其抗体，还可以用于患者的预后评估。Fagin等[20]利用qRT-PCR技术在患者唾液样本中检测出调控EB病毒裂解复制的早期即刻蛋白BZLF1的信使核糖核酸（messenger ribonucleic acid，mRNA），并且发现该类患者病情较重。因此，唾液中EB病毒及其危险因子的检出可辅助判断口腔内各种上皮细胞的感染状态，对临床治疗提供指导。

1.3 水痘带状疱疹病毒（varicella zoster virus，VZV）

VZV是一种嗜神经细胞性的疱疹病毒。首次感染引起水痘后，病毒多隐藏于神经细胞，受外界刺激，感染可再次复发，使机体出现带状疱疹[21]。Park等[22]在52例带状疱疹患者（herpes zoster）中，通过qRT-PCR技术发现：46例患者唾液中可检测到VZV的DNA，而这46例中只有28%（13/46）的患者血浆中存在VZV。该结果提示：检测唾液中VZV的DNA可能对带状疱疹患者诊断有一定的潜在价值。但该研究纳入病例数量较少，结果可能存在偏倚，还有待大样本研究验证。此外，有研究[23]发现：带状疱疹病毒感染者唾液中VZV的DNA检出率较高，且相对于抵抗力较强的年轻患者，年龄大、临床症状重的患者唾液中该病毒的DNA含量更高。因此，唾液有望成为筛选VZV感染者以及评估患者病情的样本选择[24]。

1.4 单纯疱疹病毒（herpes simplex virus，HSV）和人类疱疹病毒（human herpes virus，HHV）

HSV-1、2感染可引起生殖器疱疹和口唇疱疹等疾病[25]。HHV-6和HHV-7与红疹、玫瑰疹等皮肤疾病相关[26]。人类卡波西肉瘤（Kaposi’s sarcoma，KS）和某些B细胞淋巴瘤等则是由HHV-8感染所致[27]。研究[28]表明：唾液中HSV-1反复脱落可能是由于HSV-1毒株重新激活所致。且相比人类免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus，HIV）感染患者，单纯带状疱疹病毒患者的HSV-1脱落量更多。通过聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）技术发现：HSV-2也可以在口腔中脱落并进入唾液[29]。HHV-6、7、8感染者的唾液中同样能检测到相应病毒的DNA[30-31]。因此，在HSV和HIV感染者中，特别是针对伴发其他感染以及免疫力低下的患者，利用PCR技术检测唾液样本中病毒的DNA载量可用于监测病毒脱落量及随访病毒是否重新激活，进而辅助指导临床[32]。

2 HIV

HIV是获得性免疫缺陷综合征的病原体，为逆转录病毒。目前认为，HIV感染可导致各种并发症的发生[33-34]。感染人类的病毒类型主要为HIV-1型和HIV-2型，其中HIV-1型毒力较强[35]。自20世纪80年代中叶起，唾液样本因可能用于HIV患者的筛查和诊断而广受关注[36]。近年来，随着分子生物学技术的进步，在唾液中检测HIV抗体具有潜在可能。文献[37-38]显示：HIV唾液筛查试剂盒可通过免疫分析法实现患者唾液中的HIV抗体与试剂盒中被标记的HIV抗原结合，且检测灵敏度和特异性分别高达93%和99%。唾液中HIV抗体作为获得性免疫缺陷综合征（acquired immunodeficiency syndrome，AIDS）筛查试剂盒的检测标志物，相对安全、方便、快速。因此，该筛查试剂盒可用于疫情暴发及AIDS高发的地区。此外，Yamada等[39]发现：在接受治疗的AIDS患者中，唾液中某些抗逆转录病毒药物（如阿巴卡韦、替诺福韦、达芦那韦等）的浓度可反映血浆中游离药物的浓度，从而有利于间接监控血药浓度，指导临床合理用药。

3 肝炎病毒（hepatitis virus）

肝炎病毒是人类病毒性肝炎的病原体。其感染人类的主要类型为甲型（hepatitis A virus，HAV）、乙型（hepatitis B virus，HBV） 和丙型（hepatitis C virus，HCV）。HAV主要通过粪-口途径传播，也可通过受污染的食物、水等传播[40]。HBV及HCV可由血液和受污染的体液等媒介进行传播[41-42]。研究者[43]对HAV感染者在确诊后180 d内唾液中HAV的免疫球蛋白M（immunoglobulin M，IgM）、总抗体以及病毒载量水平进行了纵向比较，结果发现：HAV的IgM和总抗体在HAV感染诊断后的90 d达到峰值，而在诊断后的30 d，病毒载量在抗体水平稍高时到达峰值。该研究提示：可通过检测唾液中不同的标志物（抗体及病毒载量）获得较高的人群诊断覆盖率。研究[44]发现：通过优化的酶联免疫实验（enzyme immunoassay，EIA） 来检测唾液中乙肝表面抗原（hepatitis B surface antigen，HBsAg），其特异性和灵敏度分别为92.6%和93.6%。既往的研究[45]从HBV、HCV患者以及健康人群中分别抽取20人，通过分析3组人群的唾液蛋白组发现：HBV和HCV患者唾液蛋白种类比健康者多，部分蛋白含量有所降低。此外，有研究[46]显示：对唾液样本中HBV的DNA检测有利于隐匿性乙型肝炎患者的识别。唾液中HCV的RNA的检测也有利于识别HCV患者[47-50]。

4 冠状病毒（coronavirus，CoV）

CoV是一种具有囊膜的正链RNA病毒，属CoV科。基因组分析显示：2019年出现的新型冠状病毒（severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARS-CoV-2）与2003年出现的严重急性呼吸综合征病毒（severe acute respiratory syndrome coronavirus，SARS-CoV）同属于CoV中的β属[51]，均可引起重症甚至致命性的感染。SARS的诊断依赖于流行病史和精确的实验室检查，其中最常用的是分子检测，如提取呼吸道样本进行逆转录聚合酶链式反应（reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR）或qRT-PCR[52]。qRT-PCR分析唾液和喉洗液显示：唾液中SARS-CoV病毒量多于喉洗液。在进行SARS的诊断时，唾液可考虑用作辅助诊断样本[53]。多项研究[54-58]发现：可在唾液中检测到SARS-CoV-2，提示唾液样本在SARS-CoV-2感染的诊断和治疗效果的动态评估中具有潜在的应用价值。

5 其他病毒

5.1 登革热病毒（dengue virus，DENV）

DENV是一种以节肢动物为媒介感染人类的RNA病毒。该病毒可通过血液传播、母婴垂直传播以及黏膜皮肤等途径传播[59-61]。ELISA和RT-PCR可分别从感染者的唾液中检测到DENV的非结构蛋白1（dengue virus-nonstructural protein，DENVNS1）和DENV的RNA[62-63]。此外，研究[64]发现：在继发感染DENV患者的唾液中可检测到IgG抗体。因此，在免疫分析法与聚合酶链扩增反应技术的辅助下，当受试者拒绝或无法采集常规检测样本（血液样本）时，收集唾液样本后对DENV相关蛋白和核酸进行检测则成为一种可替代的选择。

5.2 流行性感冒病毒（influenza virus）

流行性感冒病毒简称流感病毒，人类、家禽和猪是该病毒常见的感染对象。人与人之间传播的流感病毒一般为季节性流感病毒[65]，可导致急性发热性呼吸道感染，甚至伴随危及生命的并发症，尤其是对于幼儿、老年人和免疫功能低下的患者[66-67]。多项研究[68-70]基于聚合酶链扩增反应的检测方法对流感患者的唾液样本与鼻咽拭子进行检测时发现：两种样本检出流感病毒的一致性较高（＞80%），流感病毒的基因拷贝数也几乎相当。有研究[71]指出：唾液与鼻咽拭子样本联合使用提高了检测的灵敏度，比单独的鼻咽拭子具有更高的价值。

5.3 人乳头状瘤病毒（human papillomavirus，HPV）

HPV为一种无包膜的双链DNA病毒。该病毒主要侵袭人体皮肤及各黏膜的上皮细胞，包括肛门、生殖器、尿道、喉、口腔黏膜等的上皮细胞，引起寻常疣、生殖器疣、肛门癌、阴道癌、宫颈癌、呼吸道乳头状瘤病、鳞状上皮内病变等疾病[72]。肿瘤抑制基因P16过度表达可作为HPV感染的生物学标志之一[73-74]。HPV感染可分为高危型与低危型。高危型HPV可导致P16蛋白过表达[75]。头颈部鳞状细胞癌（head and neck squamous cell carcinom，HNSCC）常由HPV高危型所诱发，且其感染部位大多位于舌根及扁桃体处[76]。由于HNSCC患者HPV感染位置具有一定的特异性，因此，利用唾液样本检测该病毒的相关生物标志物逐渐受到关注。此外，HNSCC患者如果过表达P16基因，则对治疗更敏感[77]。Cohen等[78]发现：利用HNSCC患者唾液初筛HPV的DNA可鉴别出高危亚型患者，其特异性为100%，此时，对初筛患者的肿瘤活体样本进行免疫组织化学染色发现P16均表达阳性。从而证实可利用唾液样本间接筛选出表达P16的HNSCC和对治疗敏感的患者。同样，有研究者[79-80]认为：利用唾液样本诊断口咽部鳞状细胞癌有较高的特异性（≥90%）。因此，唾液样本对于HPV高危型的检测结果可信度较高，有助于头颈部鳞状细胞癌的辅助诊断。

综上所述，通过研究病毒感染者唾液中的多种生物标志物，研究者发现：多数标志物不仅能够经过目前应用广泛的分子生物学技术灵敏检出，还能根据其含量的变化等间接判断疾病的发生和发展。除以上病毒外，寨卡病毒（zika virus，ZIKV）、基孔肯亚病毒（chikungunya virus，CHIKV）、其余类型的肝炎病毒等感染后产生的标志物都有望在唾液中检出，从而达到辅助诊断和监测预后的目的[81-86]。目前，由于唾液成分动态变化大，采集过程易被污染造成假阳性，导致唾液样本的检测结果仍然不是以上各种病毒的常规诊断标准。因此，当单独应用唾液样本时，可考虑随病情发生和发展进行唾液样本跟踪检测。未来仍需进一步统一唾液采集、保存与检测的标准化方法，设定诊断相关疾病标志物浓度的阈值等，进而提高唾液样本的临床应用价值。

利益冲突声明：作者声明本文无利益冲突。