猪生物育种研究进展

李月明，毕延震

（1.湖北省农业科学院畜牧兽医研究所∕动物胚胎工程及分子育种湖北省重点实验室，武汉 430064；2.武汉大学生命科学学院，武汉 430072）

生猪产业关乎民生大计，对促进国民经济平稳发展、保障粮食安全和提高居民生活水平具有重要意义。中国是生猪养殖与消费大国，截至2019年，生猪存栏与出栏数分别占世界总量的55.78%和45.08%。然而，种猪进口依然是目前中国改善生猪生产性能的重要方式，大量进口外国猪种导致中国地方猪数量急剧下降，对中国生猪育种和养殖的长远发展十分不利［1］。克服中国生猪育种所存在的问题，充分发挥地方猪肉质好、繁殖力强、适应性好等独特的种质资源优势，是提高中国猪种国际市场竞争力，促进生猪育种可持续发展的必经之路［2］。随着猪种全基因组测序的完成，基础研究的不断深入，越来越多基因功能被注释，育种水平也从群体水平过渡到分子水平。基因编辑技术因其精准性与高效性脱颖而出，成为优势猪种选育的一把“利器”。在实际育种工作中，联合杂交育种、分子标记辅助育种以及全基因组选择育种等方法不仅可以突破技术壁垒，还将大大缩短育种时间，结合胚胎工程技术促进优势个体的扩繁，也将不断推进育种进程［3］。本文对猪生物育种技术的发展进行简要概述，并综述基因编辑技术在猪产肉性能、改善猪肉品质、提高饲料转化率以及抗病性上的育种进展，预测基因编辑技术和重大基因在未来猪育种工作中的应用。

1 猪生物育种技术发展概述

生物育种是指利用遗传学和细胞生物学理论以及现代生物工程技术培育生物新品种的过程。常规的育种技术是包括杂交育种、分子标记辅助育种和全基因组选择育种等在内的技术和方法，在以往的优良猪种选育工作中被广泛应用并卓有成效，但这些技术也存在明显不足。杂交育种可集中亲本的优良性状，但育种时间漫长、过程繁琐；分子标记辅助育种技术具有分子标记数量丰富和可操作性强的优点，但一些与目标基因相连锁的分子标记仍缺乏进一步的研究与验证，导致结果的可信度不足［4］；相比于分子标记辅助育种，全基因组关联分析通过对难以测定和选择的性状进行分析来控制选配、减少群体近交等问题，早期选择准确率更高，但价格昂贵，而且分子辅助标记和基因组选择技术仅用物种自身基因来改良品种，不对外源基因加以利用［5］；基因工程技术的优点在于可以跨越物种界限导入外源基因或通过基因沉默获得优势性状，中国的生猪育种在该育种技术上取得了一定进展，但存在随机插入风险和产生脱靶效应问题［6］。因此，仅用以往的育种方法无法满足当下的实际育种需要。

随着锌指核酸酶（Zinc finger nucleases，ZFNs）、转录激活因子样效应物核酸酶（Transcription activator-like effector nucleases，TALENs）和成簇规则间隔的短回文重复序列∕Cas9系统（Clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPRs∕Cas9）基因编辑技术的发展，人类对基因功能的研究更加深入，从而进一步提高了生猪的育种效率，加快了育种进程［7］。以CRISPRs∕Cas9为代表的基因编辑技术从遗传学角度上选育优势猪种，相比于ZFNs和TALENs具有识别位点多样、成功率高、操作简单、周期短和成本低等优势，在动植物新品种的培育、构建动物模型和基因治疗等多个领域具有广阔的应用前景［8］。不仅如此，CRISPR∕Cas9系统与Cre∕LoxP系统相结合可以删除标记基因，降低对人类基因组的潜在影响［9］。基于CRISPR∕Cas9系统的单碱基编辑技术利用CBE4和ABE4编辑器，可以将单核苷酸变异引入基因组，在不发生双链断裂的条件下产生永久的DNA编辑，提高基因编辑的生物安全性［10，11］。基因编辑技术的不断发展与创新将在家畜育种工作中发挥更大的作用。

2 猪经济性状育种进展

2.1 提高产肉性能

随着生活水平的日益提高，人们对猪肉的需求量不断上升。根据国家统计局公布数据，2020年猪肉总产量为4 113万t，而中国全年猪肉需求量约5 500万t，猪肉供给依然存在较大的缺口［12］。胴体与肉质是衡量养猪业经济的重要指标，同时也是开发地方猪种需要考虑的重要因素。肌抑制素（Myostatin，MSTN）是骨骼肌生长的经典负控因子。利用CRISPR∕Cas9系统对敲除MSTN的双等位基因，大大提高了巴马猪、两广小花猪和二花脸猪等地方猪的瘦肉率［13-15］。激活素A可以促进MSTN的表达，分别沉默鸡和山羊的激活素A受体IIB型（Activin receptor type IIB，ACVR2B），可以引起其肌肉含量显著升高，该基因为肌肉的负调节因子，敲除该基因可以作为提高猪产肉性能的一种选择［16，17］。研究表明，解偶联蛋白1（Uncoupling protein 1，UCP1）是线粒体内膜上的载体，在棕色脂肪组织的非颤抖性产热中起着重要作用。缺乏UCP1会使仔猪温度调节能力变差以及脂肪沉积增加，利用CRISPR∕Cas9系统获得UCP1-KI猪，UCP1-KI猪的脂肪溶解增加、沉积减少，使之更符合现代人的饮食习惯［18，19］。

2.2 改善猪肉品质

对于猪肉品质的广泛评价标准包括肉的外观、适口性和营养价值，肌肉组织结构的肌纤维发育与肌内脂肪的沉积决定了肉质的肉色、嫩度、风味、多汁性和系水力等关键指标［20］。表达Fat-1和Fat-2的转基因猪，猪肉中ω-3和ω-6的含量显著提高，为人们提供了一种富含多不饱和脂肪酸的新猪肉品种［21］。过氧化物酶体增殖激活受体γ（Peroxisome proliferator-activated receptor γ，PPARγ）是肌内脂肪生成和脂肪细胞分化的主要调节因子，PPARγ过表达的大白猪肌内脂肪显著增加，在保证瘦肉占比不变的情况下，猪肉的口感更为丰富［22］。猪肉贮藏是影响猪肉品质和食品安全的重要因素，钙蛋白酶抑制蛋白（Calpastatin，CAST）广泛存在于哺乳动物组织中，是钙蛋白酶的特异性抑制剂，在冷藏条件下肉类宰后贮藏过程中起关键作用［23］。CAST在成年猪的表达量显著增高，对于猪的肌肉剪切力和嫩度具有调控作用，该基因可以为猪肉品质性状的优化育种工作提供参考［24］。猪脂肪干细胞和肌卫星细胞中的全转录组差异表达分析表明，KLF6是脂肪形成的正调控因子，KLF6下调后脂滴形成显著下降，可用于减少猪的整体脂肪量，促进低脂肪猪的育种［25，26］。Zhang等［27］通过对2 448头猪背最长肌脂肪酸组成相关的32个性状进行全基因组SNP位点分析，发现ELOVL6、SCD和FASN具有显著位点，为脂肪酸成分和其他经济特征的共同遗传控制提供了新的见解，并为提高猪肉中的不饱和脂肪酸提供了相关基因策略。

2.3 提高饲料转化效率

饲料成本占养猪成本的70%，提高饲料转化率是降低养猪业经济成本和减少环境污染的有力手段。饲料转化率的主要影响因素除了饲料本身和环境因素，还包括猪自身的身体组分和新陈代谢。研究发现，通过生物育种技术获得表达特定酶类的猪种是对饲料中营养物质利用更充分的有效途径。在腮腺中表达木聚糖酶的转基因猪与非转基因猪相比，粪便中的粗蛋白含量降低了15.5%，提高了总能量和粗蛋白的消化率［28］。表达β-葡聚糖酶、木聚糖酶和植酸酶的转基因猪，比野生型猪的粪便氮和磷含量减少23.2%～45.8%，生长速度和育肥出栏速度更快［29］。此外，通过全基因组关联研究和转录组分析，围绕重要的SNP分布发现调节饲料转化率的候选 基 因 包 括TPH2、FAR2、IRAK3、YARS2、GRIP1、FRS2、CNOT2和TRHDE。TPH2具有调节猪肠道活力的潜力，GRIP1可能通过影响猪的食欲来调节饲料转化率，GRIP1、FRS2、CNOT2和TRHDE可通过甲状腺激素信号通路调节各种组织的新陈代谢［30］。利用基因编辑技术验证上述候选基因的功能和有效性，可以增进对影响猪饲料转化率遗传机制的深入了解，有利于优化节粮环保型猪的育种方案。

3 猪抗病育种进展

传染性疾病是猪规模化养殖业的最大威胁，误食患病猪肉也会对消费者造成极大的安全隐患。就目前而言，大多数疾病多以预防为主，疫苗接种是主要的预防方式，但该方法成本高、效用有限、消耗大量人力和物力。基因编辑技术可致力于传染性疾病致病机理的研究，为选育和改造出具有抗病性状的优质种猪提供更好的方案。

猪的蓝耳病又称为猪繁殖与呼吸综合征，其病原为猪生殖和呼吸综合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV），母猪感染后出现呼吸系统疾病、流产和死胎。CD163是该病毒的受体，利用CRISPR∕Cas9系统敲除母猪基因组上的CD163，母猪可免受PRRSV的感染，同时对于没有敲除CD163的胎儿也具有子宫内保护作用［31］。仅敲除CD163的SRCR5结构域的两广小花猪和大白猪可以完全抵御PRRSV-2、JXA1和MY病毒株的感染，在攻毒试验中未出现临床症状、病理异常、病毒血症和PRRSV抗体［32］。研究表明，CD163可与宿主蛋白钙蛋白酶-1相互作用，钙蛋白酶-1可以促进病毒的脱包被，这一发现对建立商品化的PRRSV抗性猪系以及进一步研究病毒感染的宿主基因位点提供 了 参 考［33］。CD163和pAPN双基因敲除猪 对PRRSV和猪三角病毒均具有绝对抗性，为感染机制的研究引入了一个有价值的模型［34］。除此之外，双crRNAs组 合靶 向PRRSV的ORF5和ORF7的mRNA可以完全清除病毒感染，该方法可以作为一种有效的抗病毒策略［35］。

口蹄疫病毒（Foot-and-mouth disease virus，FMDV）为正链RNA病毒，基因组大小约8.5 kb，是猪口蹄疫的病原，对全球偶蹄动物具有高度传染性［36］。组织蛋白酶S（Cathepsin S，CTSS）具有抑制病毒复制的作用。过表达CTSS能够抑制FMDV-O在PK-15细胞中复制［37］。研究表明，草莓缺口同源物2（Strawberry notch homolog 2，SBNO2）在细胞中参与炎症反应，敲除BHK-21细胞系的SBNO2基因，有抑制FMDV复制的作用［38］。解旋酶DDX23可以参与pre-mRNA剪接，对FMDV核糖体进入位点依赖性翻译产生负向影响，过表达DDX23可以降低FMDV的复制，对抗FMDV感染的研究具有一定的参考价值［39］。

猪伪狂犬病是由伪狂犬病毒（Pseudorabies virus，PRV）引起的猪急性传染病，病死率高达100%，能够致使仔猪腹泻呕吐，妊娠母猪流产死胎等症状，严重影响了全球猪养殖业的经济效益与发展。研究表明，RSAD2对DNA和RNA病毒均具有抗病毒活性，体外攻毒试验表明RSAD2的位点特异性整合可以有效减少PRV和典型猪瘟病毒感染［40］。膜蛋白Nectin1和Nectin2被认为是PRV感染的受体，单个基因敲除后的PK-15细胞相较于野生型细胞而言，PRV感染显著减少，该方法可以用于猪的抗PRV育种研究［41］。PRV感染后，含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶（Cysteinyl aspartate specific proteinase 1，Caspase-1）能够诱导产生炎性细胞因子，Caspase-1稳定敲除的PK-15细胞可以抑制PRV的复制，并且细胞活力不受影响［42］。除此之外，敲除PK-15的凋亡相关斑点样蛋白基因也能够抑制PRV的增殖，并且能够显著抑制子代病毒的增殖能力［43］。与之相反，TANK结合激酶1（TANK-binding kinase 1，TBK1）在抗病毒天然免疫应答和获得性免疫应答中发挥重要作用。TBK1稳定敲除的PK-15细胞系可以促进PRV复制［44］。敲除猪肺巨噬细胞系的干扰素基因刺激因子基因同样能够促进PRV在细胞中复制，这些研究促进了猪种抵御PRV感染分子机制的研究［45］。

猪圆环病毒2型（Porcine circovirus type 2，PCV2）是断奶仔猪多系统衰竭综合征的主要病原［46］。SYNGR2主要在神经元细胞突触囊泡膜中表达，PCV2在SYNGR2敲除的PK-15细胞中病毒量降低，为SYNGR2参 与 促进PCV2感染提供依据［47］。PCV2的衣壳蛋白是一种独特的结构蛋白，在病毒复制和发病机制过程中起着关键作用。PCV2的衣壳蛋白可以直接与NAP1L4的124-279位的氨基酸残基发生相互作用，过表达NAP1L4会导致PCV2的衣壳蛋白表达下调，病毒滴度降低，而敲除NAP1L4后PCV2的基因组DNA拷贝数和病毒滴度增加［48］。PCV2衣壳蛋白的泛素化降解是抑制病毒复制的有效手段。pMKRN1是一种E3连接酶，可以通过泛素化降解PCV2衣壳蛋白，过表达pMKRN1可以减少衣壳蛋白和病毒复制，有助于PCV抗病猪的育种工作研究和对pMKRN1的抗病机制的进一步了解［49］。以上研究策略也可用于开展对非洲猪瘟、猪流感和细小病毒等其他疾病的研究，从而获得具有抗病能力的育种新材料，在增强种猪抗病性的同时大大减小了饲料药物添加剂的滥用，从而实现生猪育种的可持续发展。

4 讨论

针对中国目前的种猪育种存在的外来引种占比高、育种创新性不足这一现状，育种科研单位和养猪企业等应更加重视生猪育种问题，挖掘和利用中国生猪品种的遗传资源以加强育种创新性，进一步提升中国猪种的核心竞争力。在技术层面，尽管基因编辑等技术在育种过程中存在需要改进的地方，但在各个方面均展现出广阔的应用前景。加大生物育种技术研发的投入力度，使其朝着更加精准、高效、安全、经济的方向不断创新。在完善育种和遗传评估体系上要做到“在研究上要大胆，推广上要慎重，管理上要严格”［50］。基因编辑技术将推动基础科学研究的迅猛发展，也将在促进家畜的繁殖、生长和抗病等育种工作上发挥重要作用，在构建动物疾病模型和基因治疗方面前景可观。