海象细菌性疾病的诊治

罗，王诗惠，赵诗文，孙德启，宋培刚，张赛赛，刘友林，宋新然，王伟★

（1.大连圣亚旅游控股股份有限公司，辽宁 大连 116023；2.大连海洋大学，辽宁 大连 116023；3.大连市现代农业生产发展服务中心，辽宁 大连 116023）

海象（Odobenus rosmarus）属鳍脚目（Pinnipedia），海象科（Odobenidae），海象属（Odobenus）。一般分布于北极和接近北极的海域。被列入《世界自然保护联盟濒危物种红色名录》和《濒临绝种野生动植物国际贸易公约》（CITES）附录Ⅲ。海象在19世纪末和20世纪中期由于商业狩猎而严重枯竭。近年海象细菌性疾病的症状频发，高温季节尤为严重。据报道，创伤和微生物感染是导致死亡的主要原因。随着全球气候变化的威胁不断增加，海冰栖息地的破坏再次威胁到海象的生存。有多个因素影响海象的细菌性疾病，如发育程度、局部创伤、维生素缺乏、环境和遗传等。

我国豢养海兽种类丰富，在本土物种的基础之上,从国外引进了多种观赏水生动物,此外还有很多经过选育、驯化、杂交的品种。随着豢养种类的丰富，面临的疾病危害也越发严重，尤其是细菌性疾病。在海象的易地保育过程中，面临着严重的养殖病害，尤其是在预防与控制方面，需要从业人员进一步加强，人工豢养环境的可持续发展，病原和流行病学调查是非常有必要的。

本文旨在研究的易地保护和饲养过程中，海象常见的细菌性疾病主要集中在体表。近年来抗生素类药物使用的逐步增加，致病菌对部分药物的耐药性也增加，因此寻求快速、有效的治疗方案可以减轻海兽的痛苦，使其健康生活，并为海象等海洋哺乳动物细菌性疾病的诊治提供借鉴。

1 材料与方法

1.1 材料海象（来自大连圣亚海洋世界)。胰蛋白胨大豆琼脂(TSA)培养基（青岛高科园海博生物技术有限公司）。细菌基因组DNA提取试剂盒（购于自天根生化科技(北京)有限公司）。引物（购于自生工生物工程股份有限公司）。抗生素药敏纸片（购于杭州滨和微生物试剂有限公司）。

1.2 病原菌的分离培养无菌条件下，使用胰蛋白胨大豆琼脂（TSA）,设置三个平行培养基,以平板划线法从患病海象体表分离细菌，28℃，培养24h，观察细菌生长情况，取优势菌菌株HX1纯化3次，于-80℃保存备用，从胰蛋白胨大豆琼脂分离出优势菌，继续培养48h。

1.3 病原菌的鉴定

1.3.1 形态特征观察观察培养24h后的菌落，对其大小、颜色等特征进行测量。根据革兰染色液说明书对优势菌HX1进行染色并镜检。

1.3.2 16S rDNA基因序列测定使用细菌基因组DNA提取试剂盒提取优势菌HX1的DNA，采用细菌16S rDNA通用引物(正向引物F:5'AGAGTTTGATCCTGGCTCAG 3'；反向引物R:5'TACGGYTACCTTGTTACGACTT 3'对优势菌HX1的核苷酸进行PCR扩增。

PCR反应体系：10×buffer 2.5μL，dNTP(25 mmol/L)2μL，Taq DNA Polymerase0.15μL，模 板1μL，上、下游引物(10μmol/L)各0.5μL，ddH2O 18.26μL。PCR反应条件：94℃下预变性5 min；94℃下变性30s，55℃下退火30s，72℃下延伸1min 30s，共进行30个循环；72℃下再延伸10min。

PCR产物由北京华大基因有限公司进行测序。根据测定结果，在NCBI网站用Blast软件进行同源性比对(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)。

1.4 药物敏感性试验用0.9%无菌生理盐水将培养36h的HX1制成终浓度为1.0×107CFU/mL的菌悬液，取100μL涂布于TSA培养基上，将药敏纸片贴于培养基表面。将平板倒置于28℃培养箱中培养24h，记录药敏纸片周围抑菌圈直径。根据CLSI标准对药物敏感性试验结果进行分析。

2 结果

2.1 病原菌的分离从患病海象体表分离得到一株优势菌落，将其命名为HX1，HX1在TSA培养基上生长缓慢，呈圆形，表面光滑。

2.2 病原菌的鉴定菌株HX1经16S rDNA通用引物扩增后得到的基因片段长度为1465bp，Blast分析结果表明，其与嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila)，相似度达100%。

2.3 药物敏感性试验药物敏感性试验结果显示：氟苯尼考对菌株HX1较为敏感（见表1）。

表1 HX1菌对16种抗菌药物的敏感性试验结果

2.4 血液检测在海象诊治过程中，对患病海象血液指标进行了检验。由此判断海象机体状况。根据药敏实验结果制定合适的治疗方案。采取海象尾部静脉血进行检验，血液检测结果（见表2）。

表2 海象血液检验结果

通过海象血液检测结果发现，患病海象血液白细胞偏高,中性粒细胞比例增高,总蛋白高于正常值，这说明机体有细菌感染，并有轻微脱水症状。经一段时间的诊断、治疗之后，各项血液检验指标基本趋于正常。

2.5 治疗根据患病海象的具体情况，结合药敏试验结果,主要采取药物治疗。选取氟苯尼考给患病海象口服治疗。治疗期间加强对患病海象的日常饲养管理，包括饵料摄入、环境控制、常规体检、用药后反应情况观察等工作。

针对患病海象个体病况使用相应药物进行治疗（见表3）。同时在治疗过程中，加强对患病动物的日常护理工作，动物病情逐步改善，现已痊愈。

表3 海象的治疗方案

3 讨论

在豢养海象过程中，有发生病变时，只进行了宏观检查，这可能导致对细菌性疾病的诊断不足。本研究的一个局限性是样本量过少，只针对发病个体进行了诊断治疗，未进行对照试验和其它个体的临床验证。嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila）属弧菌科气单胞菌属，为革兰氏阴性短杆菌，极端单鞭毛，没有芽孢和荚膜，广泛分布于自然界的各种水环境中，是多种水生动物的原发性致病菌，也是水生动物的条件致病菌。可引起鱼类、两栖类及爬行类动物暴发出血性败血症。本研究从患病海象体表分离出一株嗜水气单胞菌，该菌在琼脂平板上形成圆形凸起、表面光滑、灰白色的菌落。本研究基于对患病海象病因的分析诊断，结合海象临床表现，发现嗜水气单胞菌为主要的致病因子。近年来，水产养殖中细菌性和病毒性疾病频发爆发,严重影响水生生态稳定以及水产养殖业的健康可持续发展。其中,嗜水气单胞菌是一种条件致病菌,能够感染鱼、虾、蟹、贝等水生生物。

不同来源的嗜水气单胞菌的理化特性具有一定差异，美洲红源嗜水气单胞菌与斑点叉尾源嗜水气单胞菌均不分解阿拉伯糖，而团头鲂源嗜水气单胞菌与东北林蛙源嗜水气单胞菌及本研究分离的鲤源嗜水气单胞菌均能分解阿拉伯糖，因此，在生化鉴定基础上通常还需进行16S rRNA基因序列分析鉴定，以确保得到准确的鉴定结果。不同分离源嗜水气单胞菌对抗菌药的敏感性常存在差异。

通过本研究药物敏感性试验发现，氟苯尼考对从海象体表分离的嗜水气单胞菌有较好的抑制作用。选用对致病菌敏感的氟苯尼考进行治疗，效果良好。细菌抗药性的增加可能是近年来养殖业对抗生素的使用较为频繁所致,因此研究和使用新的抗菌药物治疗对海象的细菌性疾病和进行病害防治具有重要的意义。饲养环境中存在着一定数量的细菌,但不会对机体造成明显危害，当外界环境恶化或海象免疫力下降时,细菌大量繁殖，可导致海象致病。

嗜水气单胞菌是导致水生动物细菌性败血症的主要病菌，因发病周期长、致死率高，给水产养殖业造成巨大的经济损失。再加上养殖环境的复杂性和不可控性，水生动物疾病的发生与传播，往往是多种因子综合作用的结果，种间干扰等生物因素也可能会对嗜水气单胞菌的致病力产生影响。嗜水气单胞菌所携带毒力因子与其致病性紧密相关，都具有肠毒性、溶血性和细胞毒性，与动物出血病、败血症有关，其致病过程为毒素单体与红细胞膜表面特殊糖蛋白受体结合形成六聚体，聚合体插入细胞膜破坏其渗透屏障作用，使细胞破裂死亡，表现出血症状，与本研究中患病海象体表有出血点结果一致。

海象为水生哺乳动物，在饲养过程中，水环境时刻影响着海象的健康，海象的体表细菌性疾病防控可以参考鱼类，以预防为主，比如对各生态因子进行有效的调控，应用健康微生态制剂，做好调换水工作，使水环境达到最适合海象生存的条件。

患病海象口服氟苯尼考后，血液生化指标变化明显，这证实治疗方案可行，针对目前海象种群资源稀缺，基于其高发的体表细菌性疾病，需要更高效快捷的诊断方法、治疗方案和预防措施，本研究结果可为人工豢养条件下海象的健康养殖提供数据参考，同时为海象的病害防控提供理论依据。