药品中抗生素含量检测方法研究进展

田新岳， 马春芳， 张 雯， 吴春燕， 邵 倩，崔生玲， 杨 奇， 余永涛

（1.宁夏大学 农学院，宁夏 银川 750021；2.宁夏兽药饲料监察所，宁夏 银川 750004）

抗生素是指由微生物或高等动植物产生的具有抗病原体或其他活性，能干扰其他细菌发育功能的一类次级代谢产物[1]。抗生素能通过抑制细菌细胞壁合成，增强细菌细胞膜通透性，干扰细菌蛋白质合成以及抑制细菌核酸复制来发挥抑菌作用。

抗生素被广泛应用于细菌感染的治疗，如氨基糖苷类和β-内酰胺类抗生素，可用于治疗需氧革兰氏阴性杆菌所致的感染，β-内酰胺类抗生素对梅毒、钩端螺旋体等的感染也具有良好的治疗作用；四环素主要用于治疗立克次体、衣原体、螺旋体的感染，也可用于恶性肿瘤、各种囊肿及顽固性胸腔疾病的治疗。抗生素也被广泛应用于畜禽感染的治疗。如大环内酯类（红霉素、螺旋霉素、替米考星）常用于治疗因金黄色葡萄球菌引起的乳房内感染；林可酰胺类抗生素（林可霉素）用于治疗和控制疾病，如猪的痢疾和猪增生性肠病，鸡的坏死性肠炎，奶牛的急性乳腺炎和绵羊的传染性足腐病[2]；氨基糖苷类抗生素盐酸大关霉素用于治疗动物呼吸吸道和胃肠道等疾病。

近年来，人们越来越关注自然环境中新兴的有机污染物——药物残留[3-4]。在药物研究中，抗生素类药物由于其对细菌耐药性发展和对自然社区的毒性以及最终对公共健康的影响而被列为优先事项[5]。抗生素在环境中的残留，可以促进细菌中单一、交叉和多重耐药性的形成。一旦抗生素抗性基因存在于自然环境中，它们可能不会消失，甚至会在细菌群落之间横向转移到人类。农业生态系统中的植物可能通过废水再利用来吸收抗菌药物和耐药基因，进而可能接触动物和人类，给人类造成严重危害。据报道[6-7]抗生素类药物可以抑制土壤分解能力，发挥其潜在的遗传毒性作用，对生物造成生态危害，并影响当地环境和生态系统。人类体内大部分病原体耐药性的产生与人类使用抗生素药物有关[8]。因此，加强抗生素类药物的监管，对生态环境保护具有重要的意义。

据统计，《中华人民共和国药典》（2020 版）[9]收录抗生素品类366 种，《中国兽药典》（2015 版）[10]收录抗生素品类81 种，《兽药质量标准》（2017 版）[11]收录抗生素类药物58 种。在上述药典或标准中，用于药品中抗生素含量检测的方法主要有抗生素微生物检定法、紫外-可见分光光度法和液相色谱法等。近年来，液相色谱-质谱联用分析法、气相色谱法、液相色谱飞行时间质谱法等也被广泛应用到药品抗生素含量检测的研究和应用中。本文对近年来抗生素含量检测方法的研究和应用进行综述，以期为抗生素类药物的质量控制和研究应用提供新的思路。

1 抗生素微生物检定法

抗生素微生物检定法是通过检测抗生素对微生物的抑制作用来计算抗生素活性的一种方法，主要包括管碟法和比浊法。抗生素微生物检定法采用活菌检测，灵敏度高，能直接显示抗生素的抗菌效价，是诸多抗生素含量检测不可或缺的方法，特别是由生物发酵产生的多种组分抗生素，主要采用该法来测定其含量。目前，抗生素微生物检定法被广泛用于诸多抗生素类药物的含量测定。

1.1 管碟法

管碟法是抗生素效价测定的国际通用方法，管碟法是利用抗生素在琼脂中的扩散作用，形成抑菌圈，根据抑菌圈的大小计算生物活性的一种方法。目前，管碟法仍在各国药典中广泛应用。管碟法的抑菌原理是抗生素在菌层培养基中扩散时，会形成抗生素浓度由高到低的自然梯度，即扩散中心浓度高而边缘浓度低。因此，当抗生素浓度达到或高于MIC（最低抑制浓度）时，试验菌就被抑制而不能繁殖，从而呈现透明的抑菌圈。根据扩散定律的推导，抗生素总量的对数值与抑菌圈直径的平方成线性关系，根据抑菌圈直径的大小即可计算抗生素生物活性。

《中华人民共和国药典》（2020 版）所描述的抗生素含量测定方法有4 种，其中有71 种抗生素采用抗生素微生物检定法，约占抗生素类药物的25.4%。如大环内酯类抗生素乙酰螺旋霉素、吉他霉素；氨基糖苷类如妥布霉素；β 内酰胺类如磺苄西林钠等。《中国兽药典》（2015 版）所描述的抗生素含量检测方法有2 种，其中31 种采用抗生素微生物检定法，约占抗生素类药物的39%。如大环内酯类抗生素如硫氰酸红霉素、吉他霉素、泰乐菌素、红霉素；氨基糖苷类抗生素如安普霉素、卡那霉素、盐酸大观霉素、链霉素、新霉素；四环素类如土霉素；多肽类抗生素如杆菌肽锌等。目前，欧盟药典和美国药典依然采用管碟法，如泰万菌素、大观霉素、酒石酸泰乐菌素采用管碟法测定效价。《兽药质量标准》（2017 版）所描述的抗生素含量测定方法有3 种，约64%的抗生素采用抗生素微生物检定法测定效价，如土霉素注射液和土霉素钙预混剂。

除用于药品抗生素含量测定外，管碟法还广泛应用于饲料添加剂中非法添加抗菌药物的检测和药物生产中间产物的检测等。杨修镇[12]应用管碟法对兽药散剂中非法添加抗菌药物进行了快速检测。Biarnes-Carrera M 等[13]应用管碟法和卡那霉素生物法测定链霉素的中间产物。管碟法也被应用于检测一些物质的生物活性。如李文婷等[14]利用管碟法测定检测重组蛋白的生物学活性，发现重组蛋白对大肠杆菌、雏沙门菌均具有体外抑菌活性。ShaoyingLi等[15]用管碟法测定乳酸菌菌株对喹诺酮类药物的抵抗力。管碟法可以检测组分复杂的发酵类药物的效价，直接检测其微生物活性，这是高效液相色谱法等化学方法所不能替代的。

管碟法操作复杂，对环境和操作人员要求高，易受环境因素影响。而高效液相色谱（HPLC）法操作简单，快速，精密度高，一些药物的含量测定逐步采用HPLC 法代替抗生素微生物法。如《中国药典》（2015版）采用抗生素微生物检定法测定红霉素软膏中红霉素的含量，刘玲[17]建立HPLC 法测定红霉素软膏中红霉素的含量，快速，操作简单，线性范围良好。《中国兽药典》（2010 版）[16]将乳糖酸红霉素、硫酸卡那霉素的含量检测方法修订为HPLC 法，使得含量检测更方便。恩拉霉素目前采用的含量检测方法为抗生素微生物检定法，而刘雅晶[17]建立了HPLC 法检测恩拉霉素的含量，与抗生素微生物检定法相比，HPLC 法快速，便捷，精密度更好，HPLC 法的重复性RSD 为0.48%，远远高于抗生素微生物法的3.26%。林仙军[18]用HPLC 法测定那西肽预混剂并与抗生素微生物检定法进行比较，差异不显著。高效液相色谱法影响因素少，线性范围大，操作更便捷，出结果更快，用于那西肽预混剂实际检测中效率更高。王丽霞等[19]建立了HPLC 法检测药物含量，在100～900 μg/mL 范围内呈良好的线性关系，回收率为99.6%，RSD 为0.55%，稳定性良好，与抗生素微生物法检测结果相对偏差为0.42%，该方法稳定性良好，操作简单，更适合于企业对大观霉素的质量检控。

虽然管碟法操作误差大，易受环境影响，但是它可以用来测定多种组分抗生素，直接测定其生物活性，这是HPLC 法所不能替代的，所以依然在抗生素含量检测中广泛应用。

1.2 比浊法

比浊法是利用抗生素在液体培养基中对试验菌的生长抑制作用，通过测定培养后细菌浊度值的大小，比较标准品与供试品对细菌生长的抑制程度，以测定供试品效价的一种方法。此法适用于能制成均匀混悬液的微生物，抗生素可应用该方法进行效价检测。与管碟法比，比浊法对系统要求低，不易受环境、人员的影响，具有快速、灵敏度高、易操作等优点。Mariane 等[20]建立了比浊法测定乳剂中夫西地酸（FA）含量并进行方法学验证，夫地西酸在0．25～2．25 μg/mL 线性范围内，吸光度和浓度呈良好的线性关系，R为0．999 7。在重复性试验中，25、0．75 和2．25 μg/mL 浓度下的FA 的RSD 值分别为2．46%、1．03%和2．40%。在中间精密中RSD 值为1．52%。该方法具有良好的精密度，平均回收率为101．95%，准确度良好，佐剂对FA 的定量无影响，适用于乳剂中夫地西酸的含量测定；班附国等[21]建立了比浊法对泰乐菌素及其制剂的含量检测；李树刚等[22]建立比浊法对酒石酸泰万菌素可溶性粉的含量；郝秋红[23]建立浊度法测定制霉素片中制霉素的含量，在4．0～12．0 IU/mL 范围内线性良好，精密度良好。

试验菌的稳定性是影响比浊法的重要因素，所以在试验过程中要严格控制。

比浊法用于抗生素含量检测，与抗生素微生物检定法相比耗时短，影响因素少，可以替代扩散法。且该方法是一种不使用有机溶剂的技术，不会产生化学废物，绿色环保。

比浊法往往因供试品中含有杂质，影响细菌生长，并不适用于有色或混浊的供试品，且对比浊管的透明度和培养基的澄清度要求较高。此外，比浊法所需仪器昂贵，虽然在兽药典收录，但在实际应用中较少。

2 紫外-可见分光光度法

紫外-可见分光光度法（UV）是在190～800 nm波长范围内测定物质的吸光度，用于物质鉴别、杂质检查和定量测定的方法。当光穿过被测物质溶液时，物质对光的吸收程度随光的波长不同而变化。紫外-可见分光光度法用于定量时，在最大吸收波长处测量一定浓度样品溶液的吸光度，并与一定浓度的对照溶液的吸光度进行比较或采用吸收系数法计算出样品溶液的浓度。

《中华人民共和国药典》（2020 版）有8 种抗生素采用紫外-可见分光光度法测定含量。包括放线菌素D 和注射用放线菌素D，酰胺醇类抗生素的琥珀氯霉素、棕榈氯霉素以及它们的制剂。《兽药质量标准》（2017 版）[11]规定紫外-可见分光光度法为恩诺沙星可溶性粉的检测方法。紫外-可见分光光度法广泛用于各种药物检测，该方法操作简便，仪器较高效液相色谱仪器便宜，在高校和医院应用较为广泛，可进行常规的药物分析。徐长举等[24]报道了恩诺沙星含量测定的紫外-可见分光光度法，在200～350 nm 波长范围，其最大吸收波长为270 nm，线性范围为0．01～0．08 μg/mL，相关系数为0．999 6，回收率为100．47%，RSD 为1．09%；张慧辉[25]建立紫外法测恩诺沙星纳米乳，线性范围为2．5～7．0 μg/mL，平均回收率为99．67%；李振[26]采用紫外法测定吉他霉素预混剂的含量，在231 nm 处有最大吸收波长，线性范围为5．0～25．0 μg/mL，R为0．999 8，该方法与抗生素微生物检定法相比，简单快速，对环境要求低；Naveed S[26]建立了UV 法测定克拉霉素；张伟[28]建立紫外-可见分光光度法测大观霉素的含量，线性范围280～519 μg/mL，R为0．999 0，RSD 为0．7%。紫外法操作简单，快速，因此在实际应用中较广泛。

由于紫外区常会因为吸光度的波动而发生被测样品不平行现象，不能区分相近波长，且其准确度、稳定性与重复性不好，所以此法已逐渐被HPLC 法取代。

紫外-可见分光光度法不能区分相近波长的物质，但是在《中华人民共和国药典》（2020 版）中还应用于一些其他药物含量的检测。

3 高效液相色谱法

高效液相色谱（HPLC）是柱色谱的一种形式，可将高压下的样品混合物或分析物（流动相）泵入带有色谱填充材料的色谱柱（固定相）中，利用物质在两相中吸附或分配系数的微小差异而达到分离的目的，利用两相的相对移动，将被测物质在两相之间进行反复多次的质量交换，从而达到分离的目的。由于HPLC 具有分离和鉴定存在于任何样品中的化合物的能力且这些化合物含量可以很低，因此HPLC 可用于各种工业和科学应用，例如制药，环境，法医和化学药品等。

《中华人民共和国药典》（2020 版）收录的抗生素有203 种采用HPLC 法测定其含量，约占72．5%。如氨基糖苷类抗生素阿米卡星、盐酸大观霉素、硫酸依替米星及其制剂等；酰胺醇类抗生素甲砜霉素、琥珀氯霉素、盐酸林可霉素等；β 内酰胺类抗生素氨苄西、美罗培南及头孢类抗生素等；四环素类抗生素盐酸土霉素、盐酸米诺环素、盐酸多西环素等；肽类抗生素盐酸万古霉素及其制剂。《兽药质量标准》（2017版）收录的抗生素有21 种采用HPLC 法测定其含量，约占36%。如大环内酯类抗生素硫氰酸红霉素胶囊、黄霉素预混和酒石酸泰万菌素及其制剂；四环素类抗生素盐酸多西环素的制剂；氨基糖苷类单硫酸卡那霉素及其制剂。《中国兽药典》（2015 版）收录的抗生素有44 种采用HPLC 法测定其含量，约占59%，其中HPLC 法检测大环内酯类、氨基糖苷类和β 内酰胺类抗生素。大环内酯类如硫酸卡那霉素、泰乐菌素及其制剂等；β 内酰胺类抗生素如普鲁卡因青霉素、阿莫西林、青霉素钠、苯唑西林、氨苄西林等；四环素类如盐酸四环素、盐酸多西环素、盐酸金霉素、替米考星还有林可胺类抗生素如盐酸林可霉素等均用HPLC 法测定药品含量。

高效液相色谱法测定药物含量快速、操作简单、误差小，对环境要求较小，因此被广泛使用。Suneetha[29]建立了RP-HPLC 法检测头孢洛林，头孢洛林浓度在40～120 μg/mL 范围内线性良好，相关系数为0．999 9。经过验证该方法适用于原料药及其制剂中头孢洛林酯含量的测定；Maria[30]建立了HPLC 法测定万古霉素，并成功应用于定量人工灌注液和肺组织样品中的万古霉素；Agnieszka[31]建立了RP-HPLC法定量测定硫酸头孢喹酮，色谱柱为LiChroCART RP-18 色谱柱，流动相为乙腈：0．02 mol 磷酸盐缓冲液（1∶9），线性范围为0．034～0．1 mg/mL，该高效液相色谱法可快速测定头孢喹诺酯的含量，且重复性良好；Ali[32]建立了HPLC 法检测头孢洛林酯，并对头孢洛林的HPLC 分析方法进行建立和验证；Izabela Karpiuk[33]建立了HPLC 法检测头孢类抗生素，方法重复性好，灵敏度高；Decheng[34]建立了HPLC 法检测万古霉素和多粘菌素B 等抗生素，快速，灵敏；王旗[35]建立HPLC 法测恩诺沙星，色谱条件为Agilent Eclipse Plus C18，流动相为0．025 mol/L 磷酸溶液：乙腈（83∶17），pH 值为3．0±0．5，流速为1．0 mL/min，柱温25 ℃，进样量10 μL，检测器为紫外检测器，检测波长为278 nm，线性范围为0．01～0．1 mg/mL，平均回收率为99．78%，最低检测限为0．06%。该方法快速灵敏，实际应用更简便；Mohammed[36]建立了使用折光检测器的新型环保HPLC 方法分析药物中的硫酸安普霉素和克拉霉素。新开发的技术比以前的HPLC 方法简便，准确且节省时间，而它们无需任何其他步骤即可执行衍生化和提取程序。

该方法缺点是不能检测抗生素的生物活性，且色谱柱使用寿命短，成本较高资金消耗较大。

虽然HPLC 法存在一定缺点，但是它的操作简单，快速，使得其在抗生素含量检测方面被广泛应用。

4 其他方法

除了管碟法、紫外-可见分光光度法和高效液相色普法外，常用的药物含量检测方法还有毛细管电泳法。

毛细管电泳法是指以弹性石英毛细管为分离通道，以高压直流电场为驱动力，根据供试品中各组分流淌和分配行为的差异而实现的一种分离方法。侯卓[37]建立了10 种头孢菌素抗生素的检测方法，并且可以同时进行10 种抗生素的分析。毛细管电泳方法与HPLC 法都高效快速，但是毛细管电泳法较HPLC 法消耗试剂少，分离能力强，但是该方法灵敏度较低，所以推广还需要技术的提高。随着科学技术的发展，一些新的方法也被应用于抗生素的检测。许铭玉等[38]用干燥滤纸片法代替管碟法检测恩拉菌素预混剂中恩拉菌素的含量，该方法操作简单，重复性好，可以避免管碟法一些试验干扰因素，亦可对大量样品同时检测，方便快捷；Chengke[39]建立基于金纳米颗粒（AuNPs）催化能力增强，以AuNPs 为催化剂的卡那霉素的高灵敏度检测。据报道，TMB 可以被H2O2氧化，并在650 nm 处产生具有显著最大吸光度的蓝色产物[40]，在TMB-H2O2溶液中加入AuNPs后，柠檬酸AuNPs 可以催化TMB 和H2O2的反应，继续加入卡那霉素，进一步提高了AuNPs 的催化活性，并将混合物的颜色改为深蓝，用比色法测定溶液中卡那霉素的浓度，方法简单，具有合理的选择性和增强的灵敏度；Webb[41]建立了实时荧光定量PCR 检测方法，快速检测抗生素，为临床医生提供了一种工具，可以近乎实时地识别潜在的治疗失败，从而在感染期间进行知情的治疗变更并改善患者的预后；Samiha 等[40]利用在碱性到中性介质中，大观霉素可以进行衍生化反应，可以进行光谱测定从而建立了荧光法检测大观霉素，该方法简单、灵敏度高，在治疗药物监测系统和质量控制分析中得到广泛应用。

5 展望

抗生素的检测方法多种多样，目前常用的检测方法主要是管碟法和HPLC 法，管碟法虽然操作复杂，易受环境影响，耗时长，但是可以用来分析多种组分组成的抗生素，可以直接测定抗生素的生物活性，该特点是其他快速便捷的含量检测方法所不能达到的。HPLC 法快速灵敏，操作简单，对环境要求较小，因此被广泛应用。中国药典中许多用管碟法测生物活性的抗生素类药物都已修订为HPLC 法，随着药物生产工艺水平的提高，抗生素微生物法在未来可能会逐渐被HPLC 法取代。