EMT在结肠癌干细胞“干性”获得与维持中的作用及机制研究进展

康毅，周晏因 综述 朱蓉 审校

遵义医科大学附属医院消化内科，贵州 遵义 563000

结肠癌是全世界第三大常见的癌症，由于近年来早期诊断与治疗手段的进步，虽然结肠癌死亡率逐渐降低，但其五年生存率也仅为65%[1]。结肠癌转移不可缺少的条件包括结肠癌干细胞(colon cancer stem cells，CCSCs)的维持、上皮间充质转化(epithelial mesenchymal transition，EMT)、结肠癌细胞的血管生成等。其中上皮间充质转化不仅可使肿瘤细胞发生浸润、转移和耐药，还给予结肠癌干细胞一定特性、促进结肠癌干细胞的出现，CCSCs也可通过相关通路完成向EMT的转化。进一步探讨CCSCs与EMT的相互关系及其调控机制，有助于理解CCSCs 可塑性，进而促进二者的理论融合以及为结肠癌的诊断、治疗提供新的方向。

1 CCSCs

肿瘤干细胞(cancer stem cells，CSCs)是指具有自我更新能力并且可以通过自我更新和无限增殖维持肿瘤细胞群的生命力的细胞[2]；CSCs 理论认为CSCs是肿瘤的种子和源泉，是肿瘤存活、增殖、转移及复发的“起点细胞”或“动力细胞”，在整个肿瘤的产生与生长过程中起着不可替代的作用。CCSCs 是结肠恶性肿瘤中一小部分拥有自我更新与无限增殖能力，而且可以形成异质性结肠癌细胞的细胞亚群，并受基因组、表观遗传因素和肿瘤微环境等影响[3]，虽然其在肿瘤总体细胞中的占比很小(0.1%～0.25%)，却与结肠癌的产生、增殖、转移和不良预后有着相当密切的联系。早期结肠癌组织内干细胞特性的激活能够促进癌细胞的增殖、侵袭[4]，在SCHWITALLA等[5]的研究中证实，核因子(NF)-κB能够通过活化的Wnt 信号通路，在炎性肿瘤微环境中可以诱导非干细胞去分化，使组织获得致瘤性，并且肠上皮细胞NF-κB 的功能亚基RelA/p65 的敲除可以阻止肠腺窝干细胞的扩增，这表明炎症信号对CCSCs 的产生及去分化产生重要影响。此外，来自YANG 等[6]研究表明，在正常和辐射环境下，CCSCs和非CCSCs之间具有一定的转换和动态平衡能力，在此过程中，TGF-β 或许通过激活EMT从而在平衡中起重要作用。

2 EMT

在人体的组织中有各种细胞，而间充质细胞和上皮质细胞是不可或缺的两种，它们在细胞表型和细胞功能上具有明显差异。上皮细胞显示出显著的极性，它们面向体表或有腔器官的腔面的一面称为游离面，面向深层结缔组织的一面称为基底面，两者在结构和功能上存在明显的不同，上皮细胞在结构上有清晰的边界，分层排列，细胞间存在着中间连接、闭锁连接、通讯连接和桥粒等，从而细胞彼此之间连接十分紧密，使得单个上皮细胞缺乏活动性，它的移动由整层细胞形状变化所引起。然而，间质细胞没有显著的极性，细胞间的黏附作用相比上皮细胞较弱，缺乏局部特异性和可塑性，它可以通过在细胞外基质的游走，据此实现单个细胞的移动[7]。EMT是指通过一定程序将上皮细胞转化为具有间质表型细胞的生物学过程[8]，具体而言，是指除去部分上皮细胞已分化的表型，从而获得了部分间充质细胞的表型[9]。因而EMT 及其逆转过程MET在胚胎发育、慢性炎症、肿瘤的发生发展和浸润转移等过程扮演着十分重要的角色[10]。EMT的发生受转化生长因子-β (TGF-β)、Wnt/β-catein、Notch、核转录因子-κB(NF-κB)、磷脂酰肌醇-3 激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)等信号通路调控，其中关键环节是这些转录因子或信号通路抑制上皮组织中的细胞黏附分子钙黏蛋白(E-cadherin)、紧密连接蛋白(ZO-1)、细胞角蛋白(CK)等的表达，诱导间充质细胞表型标志物N-钙黏蛋白(N-cadherin)、波形蛋白(Vimentin)、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、成纤维细胞特异性蛋白1(FSP1)和骨桥蛋白(Osteopontin)等表达，导致细胞间的黏附力减弱，并且结肠癌细胞的侵袭能力提高。

3 EMT是CCSCs形成的关键

2007 年，O'BRIEN等[11]分离出CD133+结肠癌干细胞，其后发现的主要结肠癌干细胞标志物包括CD133、Lgr5、CD44、CD166、EpCAM、ALDH1、CD24、CD26、ITGB1、Oct4、Sox2、Nanog 等，这些CCSCs标志物的发现，不仅利于结肠癌的诊疗，而且还有助于探索新的结肠癌靶向治疗方法。发生EMT时，上皮细胞在某些特定的情况下向间充质细胞转化，此转化过程会导致上皮细胞的极性的丧失，此时细胞间的紧密连接和中间连接等重要连接丢失，与周围细胞和基质的接触减少，而细胞迁移、侵袭、增殖等能力得以增强[12]。肿瘤细胞发生EMT 伴随着上皮表型分子(E-cadherin、α-catenin、β-catenin、细胞角蛋白、黏蛋白、桥粒蛋白)的下调和间充质表型分子(Vimentin、纤连蛋白、神经型钙黏蛋白、基质金属蛋白酶 MMP-2、MMP-3、MMP-9)的上调，它增强了细胞迁移和侵袭的能力，并且在肿瘤复发和耐药性中也扮演者重要的角色。新近研究表明，EMT和CCSCs之间或许存在着密切的关系，EMT可以刺激肿瘤干性的产生。

EMT 诱导的CCSCs 和致瘤性的机制，包括相关基因和各种通路被证实参与其中。研究发现，发生EMT 的肿瘤细胞具有干细胞样的特征[13]，目前参与CCSCs 生长的信号通路主要有 Wnt、Notch 和 mTOR等信号通路。转谷氨酰胺酶2(TGM2)在CCSCs中的有一定作用，TGM2 在致瘤细胞中的表达水平比非致瘤细胞高25 倍，通过特异性RNA 干扰敲除TGM2 可以显著抑制细胞生长并引起干性标记CD133、SOX2和β-catenin 的下调，敲低TGM2 可以通过下调N-cadherin和Vimentin以及上调E-cadherin来抑制细胞转移能力。人结肠直肠癌中TGM2表达显著增加，而下调TGM2 可作为结直肠癌患者的治疗方法。这表明TGM2 通过调节EMT 和干性相关蛋白影响CCSCs 的转移潜力和干性，CSCs 的转移潜力来自高表达的TGM2[14]。R-spondin(RSPO)家族是近年来新发现的由4种分泌型蛋白组成的蛋白家族，其中RSPO2 是经典Wnt/β-catenin 途径的激动剂，是肠道干细胞(ISCs)的生长因子，被认为在CCSCs中起着重要的作用。但是，尚不清楚RSPO2在CCSCs 中的具体功能，有研究表明，RSPO2可通过增强EMT 促进HCT116 球状细胞的侵袭，RSPO2是CCSCs 的潜在生长因子，通过无血清DMEM/F12 培养基(SFM)培养有助于丰富CCSCs，并且在结肠癌的转移中起着至关重要的作用[15]。此外，有研究表明，PRDX2可以抑制TGF-β1诱导的结直肠癌细胞的EMT进程，并可促进MET发生，使结直肠肿瘤细胞侵袭和转移得到抑制[16]。

肿瘤的转移和复发一直是肿瘤治疗所面临的一项严峻挑战，有证据显示，CSCs 和EMT 是肿瘤形成、转移、复发的关键因素。研究发现，当Bmi-1 被小干扰 RNA(siRNA)沉默时，CD133+/CD44+HCT116 细胞的侵袭和迁移能力显著降低，RT-qPCR 和蛋白质印迹分析的结果表明Bmi-1 对E-cadherin 的表达有负面影响，Bmi-1 或许经过诱导 EMT 下调 E-cadherin 促进CCSCs 的侵袭和转移[17]，使得Bmi-1 有望成为结肠癌治疗的新型治疗靶标[18]。尽管较早的研究表明CCSCs与EMT 在肿瘤发展中有一定联系，但关于CCSCs 与EMT之间的关系仍存在争议。研究发现，球形细胞显示出较低的同型/异型黏附力，但具有更高的体外迁移/侵袭能力，以及更高的体内致瘤和转移潜能。球状细胞还显示出 E-cadherin 下调，α-SMA 和 Vimentin 表达上调，这也证明了EMT的发生。它表明球状细胞具有CCSCs的特征，EMT则可能解释了它们的干性和恶性，而Wnt/β-catenin途径的持续激活可能在CCSCs的EMT中起重要作用[19]。

药物作用及肿瘤微环境因素也是EMT向CCSCs发生发展的重要因素。非甾体类抗炎药阿司匹林通过上调E-cadherin 表达，下调N-cadherin、Vimentin、Snail1表达从而抑制HT-29细胞EMT；非甾体抗炎药可通过EMT减弱人结肠癌细胞的迁移和侵袭能力[20]。肿瘤微环境包括炎症、酸性、低氧等，它们与结肠癌细胞的发生、生长等关系密切[21]。研究发现，在结直肠癌中，肝细胞生长因子(HGF)可以促进癌细胞的EMT，此过程还伴随着肿瘤细胞中Wnt信号通路的激活[22]。间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)可以在化疗中分泌多种生长因子，如IGF-1、VEGF 和 HGF 等；还有趋化因子SDF-1/CXCR4 以及炎症细胞因子IL-6 和TNF-α等，这些生长因子通过STAT3、PI3K/AKT和Wnt等信号通路的作用，使得肿瘤细胞避免被化疗药物所损伤，并触发肿瘤细胞的EMT 与干细胞特征[23]。

4 CCSCs对EMT的影响

微小RNA(miRNA)于1993年首次发现，是一大家族的小分子非编码18-25 nt 单链寡核糖核苷酸，在转录后起作用，负调控信使RNA(mRNA)的翻译。近期研究发现，转录因子Ascl2 通过转录调节miRNA-200家族，进而抑制结肠癌HT-29 和LS174T 细胞株的EMT，从而影响结肠癌的浸润和转移[24]。微小RNA是肿瘤发生EMT与转移的调控因子，并且miR-200家族(miR-200a、miR-200b、miR-200c、miR-141与miR-429)和miR-205家族可以激活EMT过程，其作用机制与上皮细胞的E-cadherin 的表达降低有关[25]。MSCs 在体外可以抑制人结肠癌细胞SW480的转移，这一作用可能与SW480 细胞的EMT 受到抑制有关，而其作用机制可能与Wnt/β-catentin信号通路有关。

在结肠癌中，化疗和/或放疗会导致耐药细胞的形成，这些耐药细胞会通过EMT转移，EMT介导原发肿瘤中癌细胞的侵袭和转移特性，使其失去细胞黏附能力，从而增加细胞间的分离，Polycomb 组蛋白(例如BMI1、SUZ12 和 EZH2)也存在失调，并且 microRNA-200 (miR-200)家族的表达也发生了变化。一项研究表明，DLD-1结肠癌细胞暴露于梯度浓度的奥沙利铂(一种用于结肠癌的化学疗法药物)中产生一种化学抗性结肠癌细胞系(DLD-1-OxR)，测试其EMT 特性，发现其表现出EMT 特征，SUZ12 在DLD-1-OxR中上调，以SUZ12 为标靶的miRNA-200 家族成员被下调[26]。

癌的进展是一系列复杂的事件的结果，被认为包括了EMT的可逆发展过程，在体外，microRNA-200家族通过转录后抑制E-cadherin 阻遏物ZEB1 和ZEB2来维持上皮表型，EMT 参与转移级联反应，并表明miR-200 在基质浸润的初始阶段被下调，但在转移部位得以恢复[27]。在EMT 期间，转录因子(如ZEB1、SIP1、Snail1 和 Slug)的增加会强烈抑制 E-cadherin 基因的转录，使上皮细胞间特有的强相互作用减弱。E-cadherin 抑制物可分为两类[28-31]：一类为直接抑制物，如Snail1、Slug、ZEB1、ZEB2(SIP1)和E47，能够直接抑制E-cadherin 的转录，另一类为间接抑制物，如Twist、Goosecoid、FOXC1 和 FOXC2 间接地下调 E-cadherin的转录。细胞因子转化生长因子-β(TGF-β)是EMT的有效诱导物，miR-200 家族的过表达阻止了TGF-β诱导的EMT，暗示miR-200 家族是EMT 的调控者。也有资料显示，miR-200 家族可以通过抑制ZEB1 和SIP1的翻译来调控EMT[32]。研究表明，对结肠癌干细胞实行基因芯片分析曾发现：CCSCs除了可以高表达CD44 和CD166 以及其他干细胞标记分子外，调控EMT 的Snail 也可以同步高表达[33]。综合以上研究证据，可以证明CCSCs和EMT之间存在密切联系。

5 EMT和CCSCs的共同影响因素

结肠癌上皮细胞的EMT 是双向、不完全的过程，EMT 与CCSCs 会受多种因素的调节。当肿瘤细胞发生 EMT 时，许多 EMT 相关转录因子(ZEB1、ZEB2、SNAIL、TWIST)的蛋白活性或基因表达快速地变化，从而调控其下游相关基因簇的表达，达到影响患者的预后的目的[34]。EMT在增强细胞侵袭能力的同时，其相关的转录因子如锌指蛋白转录因子SNAIL 可促使结肠癌细胞获得CSCs 的特性，从而获得放化疗抵抗能力[35-36]，SNAIL 是 EMT 的激活剂，在结肠癌分离出的结肠球中以高水平表达，SNAIL在结肠癌细胞中的过表达诱导了结肠球的大多数特性，包括细胞去分化。SNAIL 调节IL-8 和其他基因的表达以诱导CCSCs的活动[33]。TWIST是一种具有碱性螺旋-环-螺旋结构域的转录因子，TWIST 包括TWIST1 和TWIST2两种亚型，有研究发现，TWIST1 是一种癌基因，也是EMT 的主要基因[37]。TWIST 也可通过上调胚胎基因的表达，从而介导胚胎的发育[38]，新近研究证实，TWIST可使肿瘤细胞一部分基因簇再编程，从而调控肿瘤细胞的EMT活动[39]。也有研究发现，TWIST在结肠癌组织中比癌旁组织的表达高，可驱动CSCs 相关基因表达，从而促使肿瘤细胞获得干性[40]。TWIST1可使结肠癌HCT116 细胞发生EMT表型转化，降低上皮细胞标志物E-cadherin 表达，并提高间充质细胞标志物 Vimentin 和 N-cadherin 表达，诱发 EMT 过程并促进肿瘤的转移[41]，从而获得干细胞特性，并进一步通过ABCB1/P-gp途径增强结肠癌自身耐药性[42]。

6 展望

CCSCs 是结肠癌产生、转移、复发及产生耐药性的根源，是结肠癌治疗失败的重要因素，EMT 也是结肠癌侵袭的关键环节。EMT 不仅增强结肠癌细胞转移和侵袭能力，而且反馈性促进CCSCs 形成，CCSCs也参与了EMT 的维持及启动，它们并不是绝对的因果关系，而是相互调控，并且受多种药物和环境因素等的影响。寻找具有高度特异性的治疗标靶是防治结肠癌的重要方式，探索EMT 和CCSCs 之间的转化关系、深入研究该调控网络中的关键靶点，有望为结肠癌转移与复发的靶向治疗开辟新思路，也必将成为核心发展方向。EMT 对CCSCs 的调控及分子机制目前不甚明了，在后续探索中，需进一步研究EMT 与CCSCs的双向调控机制、处于不同分化阶段的CCSCs与EMT的关系以及EMT和CCSCs靶向治疗的安全性等，如若阻断EMT 或可能将CCSCs 转化为其终末细胞抑制增殖，将CCSCs转化为具有较高分化程度的结肠癌细胞，为结肠癌的治疗发掘更有效的手段。