药品无菌检查中污染微生物的鉴定

陈静，夏培培(江苏九旭药业有限公司，江苏 徐州 221000)

0 引言

若想确保无菌制剂药品使用安全，其中做好药品无菌检查工作非常必要。这有利于保持现下无菌制剂药品质量水平，降低临床用药阶段诱发不良反应概率。微生物在使用的药品中存活，不仅威胁用药者生命安全，也会导致药品生产企业面临巨额经济损失风险。为了更好地保证药品质量，必须重视与加强药品无菌检查，做好微生物污染鉴定，确定污染源，为药品质量安全管理工作高质量开展提供基础保障。

1 药品无菌检查中污染微生物鉴定必要性分析

无菌制剂用药安全与前期药品无菌检查工作质量有着十分密切关联性，同时也直接影响着无菌制剂质量评控水平以及临床不良反应情况的出现概率。通过对近些年来药品无菌检查实际情况的调研与分析，发现无菌药害事件发生频率逐渐提升。但由于药品质量安全监管各项工作精准落实，使得无菌药害事件所造成的负面影响并没有扩大，这其中药品无菌检查在此过程中发挥了关键性作用。无菌药品污染主要来自三个方面，分别是物理性污染、化学性污染以及微生物污染。其中导致微生物污染问题出现的成因较多，微生物污染是指在各种因素综合作用影响下，使得无菌药品中微生物含量超过国家规定标准，继而发生微生物污染情况。微生物具有体积小、生长繁殖快、种类多以及适应强等特征，这在一定程度上加大了药品无菌检查难度，同时对此方面工作提出严格要求。目前国家现行《药品生产质量管理规范》相关条例对药品中微生物限量有着明确规定，要求通过开展药品无菌检查工作，对微生物限量进行监管，尽可能消除对无菌制剂对用药者生命安全的威胁。

从现阶段我国临床用药情况来看，用药频率逐年呈上升趋势，在一定程度上加大了药品质量安全监管难度。为了充分发挥药品无菌检查功能作用，必须做好污染微生物鉴定工作并确认药品无菌检查过程中是否会对药品带来污染影响。以明确微生物污染源，为进一步优化与完善优化药品无菌检查提供有价值参考依据。

2 污染微生物鉴定实验

2.1 实验准备

污染微生物鉴定的实验准备流程如下：(1)实验研究对象：革兰式阳性球菌，数量为7株；(2)实验要求：分别在两个无菌且独立的实验室环境条件下开展污染微生物鉴定试验，根据本次实验具体要求，配置相应数量实验人员，要求参与实验的人员均要独自完成鉴定无菌药品的实验任务；(3)基于国家现行《中华人民共和国药典》规范标准，对产地、批次均不同的药物进行无菌检查；改良马丁培养基与硫乙醇酸盐为培养基样品，且存在处于生长状态的微生物，培养时间设置为24 h，环境温度设置为35 ℃，本次实验期间细菌总计收集7株；(4)将7株细菌微生物作为本次污染微生物鉴定实验研究对象，通过一系列鉴定与分析，确定微生物污染源。

2.2 实验方法

本次鉴定细菌微生物过程中，选择细菌基因组DNA提取试剂盒辅助实验人员提取微生物基因组DNA，在提前准备好的TE缓冲液中存放所提取的细菌DNA。为满足药品无菌检查中污染物微生物鉴定要求，将选择三种鉴定方法，分别是全自动微生物生化鉴定、16SrRNA基因测序鉴定方法以及RiboPrinter仪器鉴定，这三种鉴定方法主要负责细菌鉴定，其中Ribo Printer仪器分型法、16SrRNA基因同源分型法以及DiversiLab仪器分型法用于分析各菌株同源性[1]。另外，为了保证本次鉴定实验结果准确性，要求参与鉴定实验的人员均要具备较高专业水平和丰富的实验经验，确保细菌鉴定与分型实验操作规范性、标准性，从而将微生物污染源如实反映。

2.3 实验结果分析

2.3.1 细菌鉴定结果

本次鉴定实验共选择7株细菌，其中全自动微生物化鉴定、16SrRNA基因测序鉴定方法以及RiboPrinter仪器鉴定三种方法所显示的6株细菌鉴定结果信息一致，表皮葡萄球菌为实验室环境中的细菌。经过一系列鉴定操作，样品鉴定结果呈阳性，分别是表皮葡萄球菌、沃氏葡萄球菌(呈奶白色状)、溶血葡萄球菌。

2.3.2 细菌同源性鉴定结果

鉴定与分析细菌同源性的过程中，实验人员采用了多种鉴定法。采用Ribo Printer仪器对细菌分型后，发现溶血葡萄球菌分型无明显变化特征，沃氏葡萄球菌与表皮葡萄球菌分别存在2种和3种结果。

采用16SrRNA基因同源分型，发现在基因水平方面，溶血葡萄球菌和沃氏葡萄球菌二者之间差异性变化较小，表皮葡萄球菌结果存在2种。通过对比此鉴定方法下细菌同源性结果，基于参照的16SrRNA基因序列，发现结果信息显示仅存在基因突变1个。

采用DiversiLab仪器分型，溶血葡萄球菌、表皮葡萄球菌、沃氏葡萄球菌分别存在2组、3组、2组。通过分析葡萄球菌污染源，各实验样品中并未出现细菌交叉污染情况，但其中一项样品被沃氏葡萄球菌污染的几率较高；因此环境因素并不是表皮葡萄球菌污染源，与自身因素有着十分密切的关联性。

2.4 实验结果讨论

从药品质量安全监管角度上分析，药品无菌检查工作有效性开展，不仅有利于促进药品质量提升，在一定程度上也能起到减少临床用药阶段诱发不良反应情况出现，是实现药品质量安全监管落实的必要途径。通过对目前药品无菌检查情况调研与分析发现，现有污染微生物鉴定方法较为多样，如全自动微生物生化鉴定方法、16SrRNA基因测序鉴定方法等。其中生化鉴定法是现阶段污染微生物鉴定过程中使用频率较高的方法，但环境因素对此鉴定方法的使用效果有着较大影响，故该方法不适用于在过于复杂的环境中进行污染微生物鉴定[2]。

基于此，本次药品无菌检查中选择多种鉴定方法辅助实验开展。从整体上看，每项鉴定方法均获得了较为精准的结果，虽然各鉴定方法在操作方面各不相同，但其结果信息显示均无明显差异。通过对照上述几种鉴定方法所显示的结果信息，发现6SrRNA基因测序鉴定方法在分析菌株层面方面存在明显劣势，难以保证菌株层面分辨率。因RiboPrinter仪器由高精密度构件组成，在较高自动化水平支持下，使得鉴定结果相较于其他鉴定方法所提供的鉴定结果其结果准确性、可靠性明显高于后者。从药品无菌检查中微生物污染源追溯鉴定情况来看，溶血葡萄球菌、表皮葡萄球菌、沃氏葡萄球菌均为诸多污染源中较为常见的几种类型。就本次实验研究结果发现：污染样品的来源为溶血葡萄球菌，通过观察各实验样品，并未出现样品间交叉污染情况；来源不同的沃氏葡萄球菌会对污染期间的样品带来一定程度上感染影响；上述提及表皮葡萄球菌来自所在环境，但环境因素并未对样品造成污染。为了进一步验证药品检查中污染微生物鉴定结果是否与实验过程中操作不规范相关，将采用OOS(超标结果)调查方法进行验证，检查药品整个无菌检查流程。

基于国家现行《中华人民共和国药典》规范标准与GMP要求，具体要求如下：(1)实验期间，所有参与实验鉴定的人员均具备相应专业资质，对药品无菌检验流程熟悉程度较高，各实验环节均严格按照规范进行操作；(2)实验全过程所涉及到的仪器设备各项参数设置均未出现误差，并无故障问题，符合污染微生物鉴定实验要求标准；(3)实验期间所涉及到样品、培养基、冲洗液等，在实验前期均做好相应消毒杀菌工序，与无菌性实验结果信息显示一致；(4)针对环境中微生物检测，仅收集到表皮葡萄球菌，其他相关环境微生物并未发现[3]。从OOS调查结果来看，药品无菌检查中来自实验室检验期间污染的可能性最低。并加上多种鉴定方法反复对照实验，可以确定药品无菌检查中微生物污染和实验室环境因素不相关，其中样品运输或样品加工环节受到污染的概率较高。因此，后期药品无菌检查过程中，相关人员应多关注药品加工及运输环节，提升对微生物污染控制重视程度，积极应用最新技术手段，为药品无菌检查工作高效率开展提供强力技术支持，从根本上保障药品质量安全。

3 加强药品无菌检查中微生物污染控制的有效建议

上述提及到药品无菌检查中微生物污染与实验室环境不相关，但药品加工及运输环节导致微生物污染问题发生的概率较高。基于此，下面将着重阐述对这两方面加强监管的措施，减少微生物污染情况出现。

3.1 人员方面

据数据显示，由于人员操作方面因素导致无菌药品中微生物含量超标的概率最高，高达70%左右。为了进一步加强对人员操作方面管控，应根据国家现行规定标准，明确制定无菌操作流程，并要求进入操作室的任何人员均要进行全面消毒，并对无菌操作区内的人员数量加以控制，一方面减少无菌操作区运动频率，规范人员操作行为，防止污染源出现；另一方面针对非加工人员进入无菌操作区，如：参观人员、设备维修人员以及质检人员等，均要在专业人员监督与指导下进入无菌操作区，待做好消毒程序后，方可进入无菌操作区，降低此方面出现微生物污染可能性。除此之外，无菌操作是降低微生物污染概率的必要途径，若药品生产人员无菌操作意识薄弱、无菌操作不规范以及个人消毒不彻底等均会导致微生物污染情况出现。因此，必须提升药品生产人员无菌操作规范性，增强无菌操作意识，在生产加工环节严格按照规范流程进行无菌操作，进出无菌操作区均要消毒，切忌大幅度运动，防止人员运动带来大量灰尘而导致微生物增多的情况出现。

3.2 设施方面

为符合国家药品质量安全标准的无菌药品生产前提，需要保证药品生产环境无菌。针对无菌环境设计，需要注意以下几点内容：

第一，严格区分无菌和有菌区域，药品生产加工环节所涉及到灭菌设备均要按照规定要求并在指定区域内存放和运输。缩短药品生产运输路线，尽可能减少微生物出现。

第二，做好无菌环境消毒工作。基于国家现行规定最新标准，选择符合规范标准的灭菌工艺，如甲醛熏蒸、乳酸熏蒸等，为了更好地保证药品生产加工环境无菌性，应根据实际生产情况，明确消毒效果最佳灭菌工艺，切实做到无菌化药品生产和加工[4]。

第三，无菌设备选择。以除菌过滤设备为例，为了保证药液在过滤过程中无微生物污染情况出现，应按照GMP规定标准，选择合适的无菌过滤设备，在过滤设备中添加双层除菌滤芯，以此来达到有效除菌目的，从根源上规避滤芯破损而出现微生物污染问题。

第四，药品运输。全过程监管药品运输，有利于确保药品质量安全，并符合国家规定标准。在实际药品运输过程中，应遵循及时、准确、安全以及规避微生物污染基本原则，严格按照现有药品运输管理制度体系开展药品运输各项工作。明确药品运输人员、药品质量管理人员责任范畴，在药品运输前期，根据药品运输各项要求，做好运输路线规划与运输工具确认工作。避免药品运输过程中出现不必要停留，有效缩短药品运输耗时。并确认所运输的药品是否存在包装破损等情况，降低微生物污染概率。

除此之外，需要完善药品运输防护措施，如：防水、防潮、防虫等相关措施，以预防与控制微生物污染。如运输特殊性药品，应按照国家相关规定执行药品运输各流程，以提高药品运输质量为原则，根据季节变化采取相应保暖与冷藏措施，规避运输环境因素导致微生物污染问题发生，切实做到全过程、全方位监管药品加工与运输。

4 结语

综上所述，污染微生物鉴定作为药品无菌检查过程中最为关键一环，通过对其的研究以调研和分析目前药品无菌检查情况，其中为了保证鉴定结果准确性，采用了多种不同鉴定方法。结果显示药品被微生物污染，与环境因素无关，其中来自药品加工或运输阶段的污染源概率较大。因此，为了降低药品被微生物污染风险，应重点加强对此方面管控，减少药品使用不良反应出现，从根本上保障药品质量。