罗汉松实多糖对小鼠肝癌H22细胞移植瘤生长的影响及其机制

李香颖，林乐珍，蓝焱焱，黄增琼

广西医科大学药学院，南宁 530021

肝癌是全球第4 大致死性恶性肿瘤，居全球癌症病死率的第3位，恶性程度高，复发率高，易转移，严重危害着人们的生命健康［1-4］。目前，索拉非尼、雷戈拉非尼和伦瓦替尼等小分子靶向抗肿瘤药物是临床治疗肝癌的常用药物，但这些药物仍存在疗效低、不良反应大和易耐药等缺点［5］。因此，寻找安全有效的抗肝癌药物具有重要的意义。罗汉松实由种子和花托组成［6］，味甘，性微温，具有行气止痛，温中补血之功效。罗汉松实多糖（PSP）是本研究小组从罗汉松果实中提取分离得到的一种植物多糖。多糖大多具有抗肿瘤、提高免疫力、抗氧化和降血糖等作用［7］。但目前有关PSP 药理活性研究的报道极少。在抗肿瘤研究方面，也未见有相关的研究报道。鉴于广西是肝癌高发区，而广西北海拥有丰富的罗汉松实资源，可提取获得大量PSP。2019 年8 月—2021 年6 月，本研究小组通过在昆明小鼠右腋皮下接种肝癌H22 细胞，建立移植瘤模型，灌胃给予PSP，观察PSP 对移植瘤生长的影响，并探讨其可能的作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物及细胞株 SPF 级雄性昆明小鼠，体质量（22±2）g，由广西医科大学实验动物中心提供（实验动物生产许可证号SCXK 桂2020-0003，实验使用许可证编号SYXK 桂2020-0004）；所有动物实验均得到广西医科大学实验动物伦理委员会批准，并严格按照批准的方案进行。H22 小鼠肝癌细胞（批号：CL-0341，武汉普诺赛生命科技有限公司）。

1.2 药品、试剂及仪器 注射用环磷酰胺（批号：2019011345，江苏盛迪医药有限公司），香菇菌多糖片（批号：H42022727，湖北广仁药业有限公司）。胎牛血清（164210-100，武汉普诺赛生命科技有限公司），MTT、IL-2、IL-6、TNF-α、INF-γ 试剂盒［Andy gene（中国）生物科技有限公司］。KQ-5200DE 型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司），UW620H型电子天平（日本岛津制作所），5810R 大型高速冷冻离心机（艾本德中国有限公司），MicroCL17R 小型冷冻离心机（赛默飞世尔科技公司），SpecraMax-Plus384型连续光谱扫描式酶标仪（香港分子仪器公司），3543 恒温培养箱（美国赛默飞世尔科技公司），CKX-41倒置显微镜（日本奥林巴斯株式社会）。

1.3 PSP 制备 按文献［8］的方法提取多糖并去除蛋白，以DEAE-52纤维素柱层析进行分离，蒸馏水洗脱，浓缩，冷冻干燥，得类白色粉末状PSP。苯酚—硫酸法检测样品中多糖含量，按葡萄糖计，多糖含量为50.64%。取PSP适量，用蒸馏水配制成高、中、低三个药物浓度（480、240、120 mg/kg），4 ℃冰箱保存备用。

1.4 小鼠H22 细胞移植瘤模型制备、分组、PSP 灌胃方法 取生长状态良好的肝癌H22细胞，离心，弃去上清液，加入RPMI1640 培养基（含10%胎牛血清）重悬，用培养基调整细胞浓度为1.0×107/mL 细胞悬液。于无菌条件下，将该细胞悬液按0.2 mL/只的量接种于小鼠腹腔内，腹水传代3 次。11 d 后，在无菌条件下，将已接种肝癌H22细胞移植瘤，腹部明显隆起的第三代腹水瘤小鼠颈椎脱臼处死，取腹腔内乳白色瘤液，用生理盐水稀释，将肿瘤细胞浓度调整至1.0×107/mL，于小鼠右腋皮下接种0.2 mL/只，建立肝癌H22 细胞移植瘤小鼠模型，小鼠右腋接种部位摸到直径约5 mm肿瘤硬块，视为造模成功。造模成功后，将54只细胞移植瘤小鼠随机分为6组，分别为 PSP 高、中、低剂量组（PSP-H 组、PSP-M 组、PSP-L 组）及环磷酰胺（CTX）组、香菇多糖（LNT）组、模型组（每组各9只），另取9只正常昆明小鼠作为对照组。PSP-H 组、PSP-M 组、PSP-L 组分别给予 480、240、120 mg/kg 的 PSP，CTX 组 给 予 20 mg/kg 的CTX，LNT 组给予100 mg/kg 的 LNT，对照组、模型组均给予10 mL/kg 的生理盐水，各组均灌胃给药，1次/天，连续给药14 d。

1.5 肿瘤抑制率和脏器指数计算 各组小鼠末次给药16 h 后，眼球取血，备用。颈椎脱臼处死动物，迅速剥离肿瘤、胸腺和脾脏，生理盐水洗净，吸干表面水分后称重（肿瘤质量），并计算肿瘤抑制率和脏器指数（胸腺指数、脾脏指数），肿瘤抑制率=（模型组平均瘤重-给药组平均瘤重）/模型组平均瘤重×100%，脏器指数=脏器重量（mg）/小鼠体质量（g）。

1.6 肿瘤组织病理学变化观察 采用HE 染色法。取各组小鼠肿瘤组织，用4%的多聚甲醛固定，肿瘤组织固定48 h 后，常规石蜡包埋、切片，切片烘干后进行HE 染色，光学显微镜观察肿瘤组织的病理学变化。

1.7 脾组织T、B 淋巴细胞增殖能力检测 采用MTT 法［9-10］。无菌条件下取各组小鼠脾脏，加入PBS磨碎，离心，弃上清液，加入2 mL细胞裂解液和4 mL的PBS，混匀离心，得到脾细胞沉淀。用RPMI1640培养基（含10%胎牛血清）将脾细胞浓度调整至1.0×107/mL。将该细胞悬浮液加入到96 孔板，100 μL/孔。其中，一板加入浓度为5 μg/mL的刀豆蛋白A（ConA）溶液，检测T细胞增殖能力；另一板加入浓度为10 μg/mL 的细菌脂多糖（LPS）溶液，检测B 淋巴细胞增殖能力。每组设置3 个复孔。培养箱中培养 3 d，每孔加入 20 μL 5 mg/mL 的 MTT 溶液，继续培养4 h，最后加入MTT 溶解液终止反应，于酶标仪570 nm处检测光密度值（OD）。

1.8 眼球血清IL-2、IL-6、TNF-α、INF-γ检测 采用ELISA 法。将各组小鼠眼球血在4 ℃环境下以3 000 r/min的速度离心10 min，取上清，按试剂盒说明书操作，检测各组血清IL-2、IL-6、TNF-α、INF-γ。

1.9 统计学方法 采用SPSS22.0 统计软件。符合正态分布的计量资料以表示，多组间比较采用单因素方差分析（One-Way ANOVA），两组间比较采用LSD-t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组肿瘤质量、抑制率比较 PSP-L组、PSP-M组、PSP-H组、CTX组、LNT组、模型组、肿瘤质量分别为（1.03 ± 0.17）、（0.94 ± 0.26）、（0.78 ± 0.72）、（0.67 ± 0.13）、（0.98 ± 0.33）、（1.67 ± 0.23）g，PSP-L组、PSP-M 组、PSP-H 组、CTX 组、LNT 组分别与模型组比较，PSP-M 组、PSP-H 组分别与 LNT 组比较，P均＜0.05；PSP-L组、PSP-M组、PSP-H组、CTX组、LNT组肿瘤抑制率分别为34.85%、40.95%、52.04%、59.44%、38.13%，PSP-H组与LNT组比较，P＜0.05。

2.2 各组脾脏指数、胸腺指数比较 脾脏指数、胸腺指数比较见表1。

表1 各组脾脏指数、胸腺指数比较（mg/g，）

表1 各组脾脏指数、胸腺指数比较（mg/g，）

注：与对照组比较，*P＜0.05；与模型组比较，#P＜0.05；与LNT 组比较，▲P＜0.05；与CTX组比较，△P＜0.05。

胸腺指数2.43±0.26*#△2.42±0.23*#△2.51±0.14*#△1.36±0.33▲2.35±0.32*#△1.82±0.23*1.70±0.18组别PSP-L组PSP-M组PSP-H组CTX组LNT组模型组对照组n 9 9 9 9 9 9 9脾脏指数4.87±0.69#△5.09±0.43#△5.56±0.68*#△3.89±0.35*#5.25±0.78#△4.47±0.39*5.24±0.01

2.3 各组肿瘤组织病理学变化 肿瘤组织病理学变化见图1，由图1 可知，模型组肿瘤细胞生长状态良好，清晰可见，数量多，排列紧密，细胞核深染，坏死细胞较少（图2A）；CTX 组肿瘤细胞数量减少，排列松散，出现不同程度的坏死区域（图2B，箭头所示）；LNT 组和PSP 各组（图2C～F），肿瘤组织疏松，肿瘤细胞减少，细胞不同程度坏死，其中PSP-H组细胞坏死更明显（图2F，箭头所示）。

图1 各组肿瘤组织病理学变化（HE，×400）

2.4 各组T、B 淋巴细胞增殖能力比较 T、B 淋巴细胞增殖能力比较见表2。

表2 各组T、B淋巴细胞增殖能力比较（OD值，）

表2 各组T、B淋巴细胞增殖能力比较（OD值，）

注：与对照组比较，*P＜0.05；与模型组比较，#P＜0.05；与CTX 组比较，△P＜0.05。

B淋巴细胞增殖能力0.58±0.12*△0.71±0.07*#△0.78±0.13*#△0.41±0.13#0.76±0.09*#△0.55±0.07*0.39±0.05组别PSP-L组PSP-M组PSP-H组CTX组LNT组模型组对照组n 9 9 9 9 9 9 9 T淋巴细胞增殖能力0.73±0.06*△0.73±0.08*△0.98±0.05*#△0.53±0.15#0.83±0.03*#△0.76±0.07*0.43±0.03

2.5 各组血清 IL-2、IL-6、TNF-α、INF-γ 水平比较 血清IL-2、IL-6、TNF-α、INF-γ水平比较见表3。

表3 各组血清IL-2、IL-6、TNF-α、INF-γ水平比较（ng/L，）

表3 各组血清IL-2、IL-6、TNF-α、INF-γ水平比较（ng/L，）

注：与对照组比较，*P＜0.05；与模型组比较，#P＜0.05；与LNT组比较，▲P＜0.05；与CTX组比较，△P＜0.05。

组别PSP-L组PSP-M组PSP-H组CTX组LNT组模型组空白组INF-γ 60.89±2.18#△81.87±1.58#△88.19±1.01#△46.63±1.69 78.65±2.58#45.35±1.42*56.59±0.37 n 9 9 9 9 9 9 9 IL-2 38.01±0.17#38.49±0.41#42.93 ± 0.24#△▲30.43±0.20#37.44±0.25#28.74±0.11*36.92±0.89 IL-6 36.48±0.72 33.23±0.67 30.83±0.60 33.81±0.53 33.75±0.53 33.28±0.60*27.48±0.89 TNF-α 149.92 ± 4.80#△159.75 ± 8.15#△182.41 ± 5.80#△128.03±12.70#155.12± 7.18#131.62±12.88*172.96± 3.46

3 讨论

肝癌是常见的恶性肿瘤之一，其病死率在恶性肿瘤中居第2 位。全世界每年约有25 万人死于肝癌［11］。目前，肝癌的治疗方法以外科手术、化疗联合放疗、基因靶向治疗为主。这些治疗手段虽然有一定效果，但肝癌患者的生存期并没有得到显著的延长［12］。可见，肝癌的防治工作仍任重道远。从中药和天然药物中寻找新的抗癌药物是当前及未来研究的重点方向之一。肝癌H22细胞来源于小鼠肝细胞瘤，并经皮下传代得到［13］。肝癌H22 细胞小鼠皮下移植瘤模型，因其接种成功率高、稳定、周期短、肿瘤位置和大小易于控制等优点，成为抗肿瘤作用研究的常用模型［14-15］。因此，本实验采用肝癌H22 细胞移植瘤模型，评价PSP的体内抗肝癌作用。

现代药理学研究表明，罗汉松提取物具有心脏保护、抑制胃癌细胞、降血脂、抗氧化及保肝作用［16-17］。本课题组前期研究发现，罗汉松实中含有多糖，并从中提取分离获得PSP。目前，有关PSP 结构及活性的研究报道极少。文献［18-19］报道，植物多糖能通过促进淋巴细胞增殖、提高自然杀伤细胞（NK 细胞）杀伤活性，调节机体免疫功能等，而具有抗肿瘤作用。PSP 作为一种植物多糖，可能具有良好的抗肿瘤作用。本研究显示，与模型组比较，PSP-L 组、PSP-M 组、PSP-H 组、CTX 组、LNT 组肿瘤质量降低；与 LNT 组比较 PSP-M 组、PSP-H 组肿瘤质量降低；与LNT 组比较，PSP-H 组肿瘤抑制率升高。表明PSP 对肿瘤生长的抑制作用与LNT 相似，并可能存在剂量依赖性。文献［20］报道，当肿瘤抑制率大于30%，且差异有统计学意义时，可认为此药有一定疗效。故可评定，PSP 能抑制肝癌H22 细胞移植瘤在小鼠体内的生长。本文结果结果显示，PSP各剂量组的肿瘤细胞不同程度坏死，其中PSP-H 组细胞坏死更明显，表明PSP 可能有促进肿瘤细胞凋亡的作用。

脾脏是体内最大的免疫器官，是T、B 淋巴细胞发挥免疫功能的重要场所。本研究显示，与对照组比较，PSP-H 组脾脏指数及 PSP-L 组、PSP-M 组、PSP-H 组、LNT 组、模型组胸腺指数升高，CTX 组、模型组脾脏指数低降低；与模型组比较，PSP-L 组、PSP-M 组、PSP-H 组、LNT 组脾脏指数及胸腺指数升高，CTX 组脾脏指数降低；与 LNT 组比较，CTX 组胸腺指数降低；与 CTX 组比较，PSP-L 组、PSP-M 组、PSP-H 组、LNT 组脾脏指数和胸腺指数升高，提示PSP 的抑瘤作用可能与其对免疫功能的作用有关，PSP-H 和LNT 均能显著提高移植瘤小鼠免疫功能，增强机体抗肿瘤免疫反应。

T、B 淋巴细胞增殖能力是评价药物免疫功能的重要指标。为进一步了解PSP 对免疫功能的影响，测定了其对脾组织中T、B淋巴细胞的增殖能力。本研究显示，与空白对照组比较，模型组、LNT 组和PSP 各剂量组T、B 淋巴细胞 OD 值均显著升高，表明模型组、LNT 组和 PSP 各剂量组 T、B 淋巴细胞增殖能力均升高，差异有统计学意义。与模型组相比，PSP-H 组 T、B 淋巴细胞 OD 值升高，表明 PSP-H 组能提高T、B 淋巴细胞增殖能力，但PSP-M 和PSP-L组T淋巴细胞OD值区别不大，表明对T细胞增殖能力无明显影响。与CTX 组比较，LNT 组和PSP 各剂量组T、B 淋巴细胞 OD 值升高，表明 LNT 组和 PSP 各剂量组T、B 淋巴细胞增殖能力均升高。与LNT 组比较，PSP 各剂量组 T、B 淋巴细胞 OD 值差异不大，表明PSP 各剂量组对淋巴细胞增殖能力的影响。结果表明，除CTX组外，其余各给药组脾组织中T、B淋巴细胞的增殖能力较空白对照组有所上升，且PSP-H和LNT对T、B淋巴细胞增殖的作用强于空白对照组和模型组，表明两者均能显著提高荷瘤小鼠免疫功能，增强机体抗肿瘤免疫反应。

IL-2 在机体免疫调节中具有重要作用，其可刺激T细胞、B细胞和NK细胞的增殖与分化，诱导T细胞分泌细胞因子，增强抗体依赖的细胞介导的细胞毒性作用，还可直接杀伤肿瘤细胞、介导肿瘤细胞的凋亡，抑制肿瘤血管的形成。IL-6 是一种高能细胞因子，是肿瘤浸润淋巴细胞中起免疫抑制作用的白细胞介素家族成员之一。IL-6可启动肿瘤细胞发生上皮间质转化，促进NK 细胞活性，刺激T 细胞增殖分泌，从而杀死肿瘤细胞。TNF-α 是抑瘤作用最强的细胞因子，对正常细胞无明显毒性，却能直接杀伤肿瘤细胞和抗肿瘤细胞增殖。INF-γ 是固有免疫系统的γδT细胞与NK细胞在识别肿瘤细胞抗原后，活化并产生的细胞因子，能直接抑制肿瘤的生长；抑制肿瘤内血管生成；上调TNF 受体的表达，增强TNF的抑瘤作用；抑制Th2细胞亚群的增殖［18］。因此，检测血清细胞因子 IL-2、IL6、TNF-α 和 INF-γ 的水平，可以反映机体的免疫功能。本研究显示，与对照组比较，模型组血清IL-6水平升高，IL-2、TNF-α、INF-γ水平降低；与模型组比较，PSP-L 组、PSP-M 组、PSPH 组、LNT 组血清 IL-2、TNF-α、INF-γ 水平和 CTX 组血清 IL-2 水平升高，CTX 组血清 TNF-α 水平降低；与 LNT 组比较，PSP-H 组血清 IL-2 水平升高；与 CTX组比较，PSP-L 组及 PSP-M 组 TNF-α、INF-γ 水平和PSP-H 组 IL-2、TNF-α、INF-γ 水平升高。表明 PSP和LNT 不是通过升高IL-6 的水平发挥作用，这与白花蛇舌草多糖抑制肾癌［21］及白术多糖抑制结肠癌肿瘤生长的作用相似［22］。我们推测，PSP 的抗肿瘤作用可能与促进 IL-2、TNF-α 及 INF-γ 的分泌，调节机体免疫功能，杀伤肿瘤细胞或促进肿瘤细胞凋亡有关。这将为进一步探索PSP在肝癌治疗中的应用提供科学基础。

总之，PSP 对小鼠肝癌H22 细胞移植瘤生长有抑制作用，高剂量作用尤为明显，其机制可能是提高机体T、B 淋巴细胞的增殖能力，升高血清IL-2、TNF-α、INF-γ水平，改善机体免疫功能。