平痤乳膏制备工艺的优化及其内外合治药效学考察

张欣荣，胡等慧

（1.河北省中医院药剂科 河北 石家庄 050011；2.北京中医药大学 北京 102488）

痤疮是一种慢性炎性皮肤病，是世界上最普遍的十大疾病，其发病率具有地域性、年龄性、种族性等特点。因其发生部位多集中于面部、背部等体表位置，极其影响美观，不仅对患者的身体造成不适，而且对患者的心理会产生很大影响[1-3]。本次将河北省中医院的临床制剂“平痤膏”进一步研发，制备得到平痤乳膏制剂，以便于更好服务于临床。“平痤”由玫瑰、丹参、茵陈、甘草等药味组成，作为临床制剂时，起初是将药材细粉与凡士林均匀混合制得凡士林膏，该膏虽具有一定疗效，但其具有药效成分溶出不完全，卫生不达标及稳定性差等问题，为了更好地发挥该制剂的疗效，在此基础上将其制备成“平痤凝胶”，虽然一定程度改善了上述缺点，但在临床使用过程中存在保湿性差等问题。因此本课题在前两种制剂研究的基础上进一步改良制成平痤乳膏，并基于中医基础理论中的“内治治本，外治治标”及“标本兼治”的原则，将平痤乳膏在外用涂抹的同时，口服载药粉胶囊，达到标本同治，内外合治的目的，以期为该临床制剂在痤疮方面的应用提供新的给药途径和理论依据。

1 材料和方法

1.1 仪器设备：C P 2 2 5 D和B S 2 1 0 S型电子天平（Sartorius,Germany）；KQ-5200DE型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；HH-S8双列八孔水浴锅（邢台德阔机械厂）；粉碎机（永康市铂欧五金制品有限公司，型号：800Y）、药筛（德立DOLO，型号：DL-248）、脱毛器（Riwa/雷瓦，型号：RF-770A）酶标仪。

1.2 材料试剂：平痤凡士林膏（自制）、平痤乳膏（自制）；平痤凝胶（自制）；痤疮软膏（百花医药集团股份有限公司，批号271256）；睾酮酶联免疫分析试剂盒（北京圣科隆生物科技有限公司，批号L180226658）；雌二醇酶联免疫分析试剂盒（北京圣科隆生物科技有限公司，批号L180226659）；中性福尔马林固定液（10%，上海源叶生物科技有限公司）；生理盐水溶液（自制）。

1.3 动物：S P F级昆明种小鼠，雄性[5周龄，体重（20±5）g，合格证号SCXK9（京）2016-0002，购于北京斯贝福实验动物科技有限公司]。

1.4 方法

1.4.1 凡士林膏的制备：按处方量，称取各中药材适量，打粉，过100筛；取凡士林适量60℃加热融化，按药材粉与凡士林2:1原则，将上述两者搅拌混合均匀，即得载药凡士林膏[4-5]。

1.4.2 平痤凝胶的制备

1.4.2.1 中药提取浓缩液的制备：中药粉末过80目筛，加8倍量90%乙醇，冷浸72 h，过滤；药渣加6倍量90%乙醇冷浸两次，每次48 h，过滤。合并3次滤液，回收乙醇得中药提取浓缩液。

1.4.2.2 平痤凝胶的制备：称取一定量的羟丙基甲基纤维素使其浓度为5%，放置4℃充分溶胀，于24 h后取出，依次加入处方量丙二醇及促透剂、中药提取浓缩液，边加边搅拌，至均匀状态，即得平痤凝胶。

1.4.2.3 Box-Behnken响应面法实验设计：本实验在前期预实验和单因素考察的基础上，选取对乳膏成品影响较大的三个因素：水相与油相的组成比A、乳化温度B和乳化剂的用量C作为自变量，以成品的稳定性、均匀性、外观状态、涂布性能、粘稠度为综合评价指标，以百分制为得分标准，各指标均占20分。考察各因素对乳膏制备工艺的影响，每个因素选取低、中、高3个水平，设计因素见表1。

表1 设计实验因素与水平

1.4.3 不同制剂的药效学研究

1.4.3.1 实验动物分组及给药：36只小鼠依随机数字表分为6组，即空白对照组、阳性对照组、凡士林膏组、平痤凝胶组、平痤乳膏组、内外合治组。空白对照组不给药，阳性对照组涂抹痤疮软膏（主要成分为硫磺和大黄），凡士林膏组、平痤凝胶组、平痤乳膏组涂抹相应制剂，内外合治组外涂平痤乳膏+内服载平痤乳膏药粉胶囊，其中内服载平痤乳膏药粉胶囊根据小鼠与人体剂量折算为每只小鼠每天每公斤体重0.4 g，将其制备成混悬液多次服用。

1.4.3.2 对小鼠性激素水平的影响[6]

1.4.3.2.1 血清样品采集及检测：各组小鼠连续涂抹给药10 d，第11天摘眼球取血，制备血清。使用ELISA法检测，得标准品光密度值，采用SAS软件进行逻辑回归分析，得回归方程。酶标仪测定各组血清样品的吸光度值，将其代入回归方程中，计算相应样品中睾酮（T）、雌二醇（E2）的含量，并计算T/E2比值。

1.4.3.2.2 皮脂腺斑组织结构[7]：皮脂腺斑是雄激素依赖性器官，包含有毛囊、大量皮脂腺及黑素团块等重要结构，可用于判断药物抗雄激素及抗皮脂腺增生的情况。本部分取“1.4.3.2.1”项下小鼠脱颈椎处死，剔除小鼠腹部的被毛，摘取下侧腹部皮脂腺斑组织放入8～10倍体积的中性福尔马林组织固定液中，HE染色切片观察。

1.4.3.3 小鼠耳肿胀抗炎实验[8]：每组小鼠连续10 d于同一时间点涂抹给药，在第10天给药45 min之后，每只小鼠右耳正反两面各涂抹0.01 ml二甲苯溶液，左耳不做任何处理。造模45 min后处死小鼠，用同一打孔器分别在两耳的相同部位打下相同大小的圆片，根据圆片重量的差值计算每只小鼠的肿胀程度，肿胀度计算公式：肿胀度（mg）=致炎后的小鼠耳廓重量-致炎前的小鼠耳廓重量；肿胀抑制率（%）=（空白对照组平均耳肿胀度-给药组平均耳肿胀度）/空白对照组平均耳肿胀度×100%。

2 结果

2.1 平痤乳膏工艺优化结果：由表2可知，最优乳膏制备工艺水相与油相比为3:2，乳化温度为80℃，乳化剂用量为2 g。

表2 Box-Behnken响应面法优选制备工艺实验设计及其结果

2.2 模型拟合：采用Design-Expert对上面数据进行分析，以Y对三个自变量A、B、C进行模型拟合，并根据相关系数（R2）等对拟合模型进行评价，通过比较各拟合方程的拟合度，得到二次多项式回归方程Y=86.40+1.38A+1.38B+1.75C-4.50AB-0.25AC-3.75BC+3.80A2-14.70B2+1.05C2，R2=0.9901，P＜0.01，F=77.55，表明模型具有极显著差异性；失拟项P=0.3220＞0.05，失拟项不显著，说明该模型拟合度和可信度均有效，试验误差小，可以用此模型对平痤乳膏的制备工艺进行分析和预测。此外，由F检验可知三个因素对综合评价的影响以C乳化剂用量最为显著，且AB、BC交互作用显著。见表3。

表3 方差分析结果

2.3 响应面优化分析：根据拟合方程，通过Design-Expert V8.0.6.1软件绘制综合评分随因素变化的等高线图和响应面图。由图1～2可以看出，当乳化温度一定时，在一定范围内，油相与水相的比与综合评分成正相关，综合评分随着油相与水相的比例增大而增大；由图3～4可以看出，油水相比一定时，乳化剂用量与综合评分成正相关，综合评分随着乳化剂用量的增多而增大；由图5～6可以看出，乳化温度对综合评分的影响成抛物线，随乳化温度的增高综合评分呈先增大后降低的趋势，当乳化温度接近于80℃时，综合评分最高。

图1 A-B等高线图

图2 A-B响应面图

图3 A-C等高线图

图5 B-C等高线图

图4 A-C响应面图

图6 B-C响应面图

2.4 优化结果：根据回归模型分析可知，制备平痤乳膏的最优条件为：水相比油相3:2、乳化温度77.66℃和乳化剂用量2.0 g。根据优化结果并考虑工业生产的实际操作可行性，各因素值均取整值，即油相与水相比3:2、乳化温度80℃和乳化剂用量2.0 g。

2.5 平痤乳膏对小鼠性激素含量的影响：使用ELISA法检测，横坐标选用标准品的浓度，纵坐标选用光密度OD值，据此进行逻辑回归分析，使用统计软件SAS对T及E2回归曲线进行拟合，拟合方程如下：

各组小鼠的睾酮及雌二醇含量如图7所示。各组小鼠血清中T/E2值均无任何统计学意义，与空白对照组相比，各组小鼠血清中T值除凡士林膏组以及平痤凝胶组外均显著降低（P＜0.01）、E2值除凡士林膏组外同样显著降低（P＜0.01），说明凡士林膏组降低小鼠体内的T与E2水平疗效很差。与阳性对照组相比，内外合治组、平痤乳膏组、平痤凝胶组小鼠血清中T值与E2值降低不明显，疗效等同，凡士林膏组略有升高，疗效较差。由以上结果可知，内外合治组、阳性对照组、平痤乳膏组和平痤凝胶均能不同程度地调节小鼠体内的激素水平，而凡士林膏组调节能力很差，各组制剂调节能力由高到低依次为内外合治组＞平痤乳膏及阳性对照组＞平痤凝胶组＞凡士林膏组。

2.6 平痤乳膏对小鼠皮脂腺斑显微结构的影响：如图8所示，空白对照组的小鼠皮脂腺体积较大，部分开口于毛囊，结构完整。与空白对照组相比，阳性对照组小鼠皮脂腺体积略变小，排列紧密；与阳性对照组相比，凡士林膏组、平痤凝胶组、平痤乳膏组三组变化不大，但内外合治组体积变小，且排列较紧密，说明内外合治组抑制皮脂腺增长的能力强于平痤乳膏组、平痤凝胶组以及凡士林膏组。由以上结果可知，内外合治组能明显地使皮脂腺腺体萎缩，控制皮脂的分泌，且效果优于阳性对照组。

图8 各组小鼠皮脂腺斑纤维结构（100×）

2.7 小鼠耳肿胀抗炎实验：小鼠耳肿胀实验结果如表4所示。与空白对照组相比，各组耳廓肿胀程度均明显减轻，其中阳性对照组、平痤乳膏以及内外合治组疗效显著（P＜0.01），凡士林膏组、平痤凝胶组疗效较差，差异无统计学意义（P＞0.05）。说明除凡士林膏组和平痤凝胶组外，其余各组均可抑制小鼠耳肿胀。与阳性对照组相比，平痤乳膏组以及内外合治组小鼠耳肿胀明显减轻（P＜0.01），疗效最佳；平痤凝胶组无差异，疗效等同，凡士林膏组耳肿胀明显重于阳性对照组，疗效最差。由以上结果可知内外合治组、平痤乳膏组以及平痤凝胶组均具有一定的抗炎作用，能够在一定程度上抑制小鼠的耳肿胀，且内外合治组疗效最佳、其次为平痤乳膏组、最后为平痤凝胶组。

表4 二甲苯致小鼠耳肿胀抗炎实验结果 （±s）

表4 二甲苯致小鼠耳肿胀抗炎实验结果 （±s）

注：**表示与空白对照组比较，P＜0.01，##表示与阳性对照组比较，P＜0.01。

组别 耳廓肿胀度/mg 肿胀抑制率/%空白对照组 13.37±0.91 -阳性对照组 10.54±0.65** 21.17凡士林膏组 12.92±0.92## 3.38平痤凝胶组 12.50±0.99 6.49平痤乳膏组 10.46±0.51**## 21.78内外合治组 9.97±1.16**## 25.43

3 讨论

本文所考察的剂型为乳膏，在实际应用中发现，外用油包水（W/O）型软膏剂相较于水包油（O/W）型乳膏剂不易挥发、失水，因此作用时间更持久，且能够在皮肤表层覆盖一层油脂膜，增强皮肤的水合作用，易于有效成分经皮递送，故最终制备W/O的乳膏，在保护中药有效成分挥发的同时更好的发挥药理作用。在W/O乳膏剂制备工艺的过程中，由响应面结果可知，随着乳化剂用量的增加，乳剂的综合评分也增加，但在实际操作过程中，在保证乳剂稳定性的前提下，乳化剂的用量应越少越好。通常在O/W的乳膏中，乳化剂的用量大约为0.5%～10%[8]，本实验乳化剂用量为2 g即可保证稳定性，故最终选用乳化剂的用量为2 g。

平痤凡士林乳膏是临床制剂，由药材细粉与凡士林混匀所得，虽然可以与凡士林大量混合，但药材中有效成分不能有效地从药材粉末中溶出，透皮性能不佳，影响有效成分发挥作用，且皮肤适应性差；平痤凝胶虽然通过提取中药材，促进有效成分以分子状态存在，但保湿性能差，涂抹于皮肤表面后，由于羟丙基甲基纤维素的自身性质，使得药物释放缓慢，相较于平痤凡士林膏药效虽明显增强，但也不及乳膏；平痤乳膏是在前期研究基础上制备新制剂，相比较前两者而言，平痤乳膏不仅有效成分提取后便于发挥作用，保湿性能好，而且易于涂抹和清洗、皮肤适应性和渗透性好、生物利用度高，在临床上具有更好的疗效。除此之外，本文基于中医理论“内外兼治”的指导原则，选用内外同治法，采用外用中药乳膏加口服载药粉末胶囊给药，其中载药胶囊内服从中医整体理念出发，通过活血化瘀、清热解毒，达到治本目的；乳膏外涂从中医局部理论出发，使药物在局部受损部位快速起效，发挥消肿止痛的作用，达到治标目的。结果显示，平痤内外合治组疗效最佳，优于单纯外用给药各组，符合中医理论中内外合治可增效的特点，在对症治疗的同时，追朔病原，发挥标本同治之功效。