Enolase在鸭疫里默氏杆菌侵袭鸭脑微血管内皮细胞中的作用

2023-01-03邹荣华吴晓妮陈启伟宫晓炜王燕萍郑福英储岳峰

畜牧兽医学报 2022年12期

邹荣华，吴晓妮，陈启伟，宫晓炜，王燕萍，郑福英，储岳峰

(中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室，兰州 730046)

细菌性脑膜炎是一种较为严重的感染性疾病，会危害人类健康，影响畜禽养殖业的健康发展[1]。在人医方面，细菌性脑膜炎是十大引发高死亡率的感染性疾病之一，且大部分幸存者会有不同程度的神经系统后遗症[2-3]。在兽医方面，养殖动物由于患脑膜炎失去了其经济价值，给畜牧业造成较大经济损失。

鸭疫里默氏杆菌(Riemerellaanatipestifer，RA) 是一种革兰阴性菌，主要感染雏鸭，导致鸭浆膜炎和脑膜炎。RA也可以感染鸡、火鸡、鹅、部分野生水禽等多种禽类。感染RA的动物，尤其是易感鸭会出现典型的神经症状，包括头颈震颤或痉挛性点头、共济失调、头颈歪斜、角弓反张、转圈等，最后衰竭死亡[4]。目前已经确定的RA血清型有21种，但每种血清型之间缺乏交叉保护，不利于疫苗免疫的普及。养鸭场在日常饲养中添加抗生素依然是最常用的防治RA的手段，但随着抗生素的应用，耐药菌株不断出现和播散[5]，给RA病的防控带来极大挑战。基于此，筛选并鉴定RA突破血脑屏障(blood brain barrier，BBB)而导致脑膜炎的相关毒力因子，研发出针对关键毒力因子的高免血清，并将其作为阻断RA感染脑组织的一种生物制品，是一种可行的研究思路。

已有的研究对RA的致病机制了解甚少，仅仅发现了几种与RA毒力相关的基因，包括OmpA[6]、VapD[7]、Yb2株的AS87_04050(参与脂多糖合成)[8]和AS87_03730[9]、CH-1株的B739_2187[10]和IX型分泌系统组分[11]。研究者发现,这些基因缺失或突变后，菌株对雏鸭的致病力有不同程度的减弱，但并未说明这些毒力基因是否与RA导致的脑膜炎相关。对于介导RA突破BBB感染脑组织，进而导致脑膜炎的相关毒力因子的研究还未见报道。

当前研究表明，烯醇化酶(Enolase)是介导猪链球菌2型突破BBB的毒力因子[12-14]。肺炎链球菌Enolase除了利用宿主的纤溶系统促进病原对宿主的入侵外，还可与宿主细胞来源的胞外RNA(eRNA)结合，进而促进细菌对肺泡上皮细胞的入侵[15]。金黄色葡萄球菌Enolase定位于细菌表面，与宿主细胞外基质的一种主要成分层黏连蛋白相互作用，参与细菌的扩散和侵染过程[16]。

迄今为止，关于RA Enolase的生物学功能还未见报道。本研究通过构建enolase基因缺失株和回复株，测定菌株的生长速率，对鸭脑微血管内皮细胞(DBMEC)的黏附和入侵能力，感染动物的血液及脑组织载菌量，以期明确enolase基因在RA突破BBB中是否发挥作用。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和质粒鸭疫里默氏杆菌RA-LZ01菌株(GenBank登录号：NZ_CP045564.1)保存于中国农业科学院兰州兽医研究所草食动物细菌病创新团队；大肠杆菌ATCC25922购自美国菌种保藏中心(American type culture collection)；大肠杆菌X7213和自杀质粒pRE112均购自NTCC国家典型培养物保藏中心；穿梭质粒pCPRA由本实验室构建；Trans-1感受态细胞购自北京全式金公司。

1.1.2 培养基和主要试剂胰蛋白酶大豆肉汤(TSB)、胰蛋白酶大豆琼脂(TSA)均购自美国 BD difcoTM公司；LB肉汤购自英国Oxoid 公司；琼脂粉购自北京Solarbio公司；2,6-二氨基更二酸(DPA)购自东京化成工业株式会社；抗生素购自北京Solarbio公司；限制性内切酶SacI、SphI，质粒提取试剂盒，胶回收试剂盒均购自TaKaRa公司；0.22 μm无菌硝酸纤维素膜和过滤器购自美国Millipore公司。

1.1.3 主要仪器紫外分光光度计和台式高速离心机购自美国Beckman公司；PCR热循环仪购自杭州博日科技公司；CO2恒温培养箱购自美国Thermo公司；摇床购自上海苏坤实业有限公司；凝胶成像仪购自美国Bio-Rad公司。

1.2 方法

1.2.1 引物设计引物均用DNASTAR-Editseq软件进行设计，由西安擎科生物有限公司合成。本研究中所使用的引物和扩增目的片段如表1所示。

1.2.2 鸭脑微血管内皮细胞(DBMEC)的培养和鉴定从樱桃谷鸭胚中分离出大脑皮质，除去脑膜等，反复用PBS冲洗干净，将组织块剪成约0.1 cm3的小块，置于培养瓶中，加入2 mL DBMEC完全培养基，确保不能将组织块悬浮，倒置于5% CO2细胞培养箱中2 h，然后将细胞培养瓶正置，待组织块周围生长的细胞融合成片，即可去除组织块，用胰蛋白酶消化细胞，重新铺瓶，传3～4代，得到符合BMEC形态的细胞。利用血管假性血友病因子(vWF)免疫荧光染色进行鉴定，得到合适的DBMEC；SV40过表达慢病毒转染DBMEC，利用嘌呤霉素(2 mg·L-1)的筛选培养基进行筛选。以未转染的DBMEC细胞作为对照，该细胞被全部杀灭，而在同一时间点存活的转染了SV40过表达慢病毒的细胞为转染成功的DBMEC，将细胞传代至12代以上，得到永生化的DBMEC。

1.2.3enolase基因缺失株的构建如表1所示，以亲本株RA-LZ01菌株基因组作为模板，用Enolase-p1/Enolase-p2和Enolase-p5/Enolase-p6引物扩增出enolase基因的Enolase-UP和Enolase-DO；以LJW-2菌株基因组为模板，用ErmF-p3/ErmF-p4 引物扩增出ermF抗性基因；通过重叠PCR将Enolase-UP、ermF抗性基因和Enolase-DO依次进行融合，构建出打靶片段；用SacΙ和SphΙ将打靶片段克隆进自杀质粒pRE112，转化进大肠杆菌X7213，利用含DPA和氯霉素的LB平板筛选阳性供体菌，再与RA-LZ01菌株共培养，利用含红霉素和多黏菌素B的TSA平板筛选缺失株，具体方法参考文献[17-18]。得到的菌株用RA保守引物OmpA-F/OmpA-R、Enolase-p1/Enolase-p6、ErmF-p3/ErmF-p4、Enolase-F/Enolase-R进行PCR鉴定，并对Enolase-p1/Enolase-p6扩增得到的片段进行测序，得到的enolase基因缺失株命名为ΔEnolase。

1.2.4enolase基因回复株的构建用表1中cEnolase-p1/cEnolase-p2引物，PCR扩增出pro+Enolase基因目的条带(含有enolase基因的启动子)。将扩增出的片段用PstI和SphI克隆进pCPRA载体中，并转化进X7213菌株中，利用氨苄青霉素抗性筛选供体菌，与ΔEnolase共培养，再利用头孢西丁和多黏菌素B抗性筛选回复株，方法参考文献[17-18]。用引物cEnolase-p1/cEnolase-p2、ErmF-p3/ErmF-p4和OmpA-F/OmpA-R进行鉴定，得到的回复株命名为cΔEnolase。

1.2.5 菌株生长曲线的测定测定亲本株RA-LZ01、缺失株ΔEnolase和回复株cΔEnolase 12 h内的生长曲线，具体方法参考文献[17-18]。

1.2.6 菌株对DBMEC的黏附和入侵将亲本株RA-LZ01、缺失株ΔEnolase以及回复株cΔEnolase分别增菌至OD600约为1.0。用无菌0.01 mol·L-1PBS(pH 7.4)调整至OD600值均为1.0，测定每株菌的菌落形成单位(colony forming unit，CFU)。用无血清内皮细胞基础培养基稀释菌液，用100个MOI(multiplicity of infection)将菌液(1 mL·孔-1)接入铺满了单层DBMEC的24孔细胞培养板中，置于37 ℃，5% CO2培养箱中孵育2 h，弃上清后用无菌PBS重复洗涤3次，每孔加入1 mL 0.25%的胰酶消化细胞，转移进1.5 mL离心管中，5 000 r·min-1离心后弃上清，并用PBS重复洗涤2次，加入0.5 mL无菌双蒸水，室温作用30 min，用PBS以10倍梯度稀释，涂板于含多黏菌素B的TSA平板上，在CO2培养箱中培养至长出单菌落，计算黏附菌株的CFU。每株菌做3个重复，进行3次独立试验。

另外，菌液(1 mL·孔-1)接入铺满单层DBMEC的24孔细胞培养板中后，置于37 ℃，5% CO2培养箱中孵育3 h，用无菌 PBS充分洗涤3次后，加入用内皮细胞基础培养基稀释好的终浓度为100 mg·L-1的氨苄青霉素钠，0.5 mL·孔-1，孵育1 h后，弃上清，经过胰酶消化、PBS洗涤以及双蒸水作用后，测定入侵菌株的CFU。每株菌做3个重复，进行3次独立试验[19-20]。

黏附率和入侵率的计算：黏附率(%)=黏附菌株的CFU/接种菌株的CFU×100；入侵率(%)=入侵菌株的CFU/接种菌株的CFU×100[21]。菌株之间的差异以相对黏附率和入侵率进行比较，把亲本株RA-LZ01对DBMEC的黏附率和入侵率设置为100%[21]。

1.2.7 动物试验 30只7日龄樱桃谷雏鸭随机分为3组，每组10只，用亲本株RA-LZ01、缺失株ΔEnolase和回复株cΔEnolase对雏鸭进行攻毒，攻毒剂量为107CFU·只-1，攻毒后40 h检测雏鸭血液和脑组织中的载菌量[4]。

1.3 统计学分析

试验数据用GraphPad Prism 6.0软件进行分析，所有数据由3次重复试验结果得到，数据采用One-way ANOVA进行分析，P<0.05认为差异显著，具有生物统计学意义。

2 结果

2.1 DBMEC的培养和鉴定

利用vWF免疫荧光对传至12代以上的DBMEC进行鉴定后，对照细胞Vero无绿色荧光出现，而DBMEC观察到绿色荧光，说明DBMEC携带vWF，为血管内皮细胞，培养成功永生化的DBMEC，细胞形态如图1所示。

2.2 enolase基因缺失株和回复株的构建

用Enolase-p1/Enolase-p6引物扩增出2 025 bp大小的目的条带(经测序确定为打靶片段)；用ErmF-p3/ErmF-p4引物扩增出801 bp大小的ermF基因；用OmpA-F/OmpA-R引物扩增出1 467 bp大小的目的条带；用Enolase-F/Enolase-R引物未扩增出条带，说明缺失株ΔEnolase构建成功(图2A)。

用cEnolase-p1/cEnolase-p2引物扩增出1 829 bp大小的目的条带(测序确定)；用ErmF-p3/ErmF-p4引物扩增出801 bp大小的ermF基因；用OmpA-F/OmpA-R引物扩增出1 467 bp大小的目的条带，说明回复株cΔEnolase构建成功(图2B)。

2.3 生长曲线的测定

与亲本株RA-LZ01相比，在测定的12 h内，缺失株ΔEnolase在4～10 h内的生长速率显著下降(P<0.01,图3)；回复株cΔEnolase的生长速率与亲本株相比慢约1 h(达到基本一致的OD600 nm值的时间)，相较缺失株其生长速率稍有提高，但没有完全恢复。

A. Vero细胞DAPI染色(200×)；B. Vero细胞vWF免疫荧光(200×)；C. DBMEC DAPI染色(200×)；D. DBMEC vWF免疫荧光(200×)；E. DBMEC(200×)A. DPAI staining of Vero cells (200×); B. vWF immunofluorescence from Vero cell (200×); C. DPAI staining of DBMEC (200×); D. vWF immunofluorescence from DBMEC (200×); E. DBMEC (200×)图1 DBMEC的鉴定Fig.1 Identification of DBMEC

A. enolase基因缺失株ΔEnolase的鉴定；M. DL5000分子质量标准；1. Enolas-p1/Enolase-p6引物鉴定(2 025 bp)；2. ErmF-p3/ErmF-p4引物鉴定(801 bp)；3. OmpA-F/OmpA-R引物鉴定(1 467 bp)；4. Enolase-F/Enolase-R引物鉴定。B. enolase基因回复株cΔEnolase的鉴定；M. DL2000分子质量标准；1. cEnolase-p1/cEnolase-p2引物鉴定(1 829 bp)；2. OmpA-F/OmpA-R引物鉴定(1 467 bp)；3. ErmF-p3/ErmF-p4引物鉴定(801 bp)A. Identification of enolase gene deletion mutant ΔEnolase; M. DL5000 relative molecular mass standard; 1. Enolase-p1/Enolase-p6 primer identification (2 025 bp)； 2. ErmF-p3/ErmF-p4 primer identification (801 bp); 3. OmpA-F/OmpA-R primer identification (1 467 bp)； 4. Enolase-F/Enolase-R primer identification. B. Identification of the complemented strain cΔEnolase; M. DL2000 relative molecular mass standard; 1. cEnolase-p1/cEnolase-p2 primer identification (1 829 bp); 2. OmpA-F/OmpA-R primer identification (1 467 bp); 3. ErmF-p3/ErmF-p4 primer identification (801 bp)图2 enolase基因缺失株ΔEnolase和回复株cΔEnolase的鉴定Fig.2 Identification of enolase gene deletion mutant ΔEnolase and complemented strain cΔEnolase

**. P<0.01，下同**. P<0.01, the same as below图3 亲本株、缺失株及回复株生长曲线Fig.3 Growth curves of parent strain, deletion mutant and complemented strain

2.4 菌株对DBMEC的黏附和入侵

与亲本株RA-LZ01相比，缺失株ΔEnolase对BMEC的相对黏附率和入侵率均极显著降低(P<0.001，P<0.0001)，分别为亲本株黏附率的5.9%和入侵率的2.5%；回复株cΔEnolase显著恢复了对DBMEC的黏附能力，为亲本株黏附率的79.6%；几乎完全恢复了对DBMEC的入侵能力，为亲本株入侵率的97.5%(图4)。

2.5 动物试验

感染亲本株RA-LZ01、缺失株ΔEnolase及回复株cΔEnolase的雏鸭，其血液载菌量差异不显著；但感染ΔEnolase的雏鸭，其脑组织中的载菌量极显著降低(P<0.01,图5)。

3 讨论

细菌导致宿主发生脑膜炎，首先要突破宿主的血脑屏障(BBB)，进而引起中枢神经系统感染和脑膜炎。BBB是指脑毛细血管壁与神经胶质细胞形成的血液与脑组织之间，以及由脉络丛形成的血液和脑脊液之间的屏障，BBB也是机体参与固有免疫的内部屏障之一[22-23]。BBB的细胞组分主要包括脑微血管内皮细胞(BMEC)、周细胞和星形胶质细胞。大量研究表明，BMEC是研究细菌突破BBB的经典模式细胞，以宿主的BMEC作为体外细胞模型，已经发现了多个与细菌侵袭血脑屏障相关的毒力因子[12-13,20-21]。本研究成功培养了DBMEC，用于筛选并鉴定鸭疫里默氏杆菌侵袭鸭BBB的相关毒力因子。

A.血液载菌量；B.脑组织载菌量A. The amount of bacteria in blood; B. Bacterial count in brain 图5 RA-LZ01、ΔEnolase和cΔEnolase菌株感染雏鸭血液及脑组织载菌量的测定Fig.5 Determination of bacteria loads in blood and brain of duckling infected by RA-LZ01, ΔEnolase and cΔEnolase strains, respectively

Enolase是糖酵解过程中的关键酶，在细胞糖酵解过程中发挥催化作用，为细菌细胞的生长提供能量[24-25]，广泛存在于真核和原核生物中。Enolase有3种异构体(α、β、γ)，原核生物中一般仅存在α-enolase，因此多种细菌表面存在α-enolase，通常称为Enolase。现有研究表明，Enolase是多种细菌的毒力因子，可介导细菌与宿主靶细胞发生黏附和结合，在细菌感染宿主过程中发挥着重要作用。尤其是有研究表明，Enolase可与猪链球菌2型(SS2)的BMEC结合，直接介导SS2对宿主BBB的侵袭；还可以促进IL-8细胞因子的释放，增强BBB的通透性[12-14]。在肺炎链球菌中，Enolase除了能够利用宿主的纤溶系统促进病原对宿主的入侵外，还可与宿主细胞的胞外RNA(eRNA)结合，从而促进了细菌对肺泡上皮细胞的入侵[15]。对福赛斯坦纳菌Enolase的研究表明，Enolase在细菌感染机体诱导炎症的过程中发挥了重要作用[26]。金黄色葡萄球菌的Enolase定位于细菌的表面，与宿主细胞外基质的一种主要成分层黏连蛋白相互作用，参与细菌的扩散和侵染过程[16]。Enolase是铜绿假单胞菌RNA降解体的重要组成成分之一，参与铜绿假单胞菌RNA的加工和基因的调节过程；Enolase也是铜绿假单胞菌的重要毒力因子，在诱导小鼠急性肺炎模型中发挥重要作用，缺失enolase基因使铜绿假单胞菌对氧化应激的耐受能力减弱，使得铜绿假单胞菌更容易被宿主体内的中性粒细胞所杀伤[27]。

Enolase在已知的测通全序的鸭疫里默氏杆菌中高度保守，核苷酸序列同源性为97.37%～100%，氨基酸序列同源性为93.95%～100%，目前对于该基因的生物学功能还未见报道。本研究构建了鸭疫里默氏杆菌的enolase基因缺失株和回复株，对缺失株的生物学表型进行了研究，发现与亲本株RA-LZ01相比，缺失株ΔEnolase的生长速率显著变慢，说明enolase基因缺失后会影响RA-LZ01菌株的生长，在RA-LZ01的生长中发挥重要作用。

对DBMEC的黏附侵袭试验中，发现ΔEnolase对DBMEC的相对黏附率和相对入侵率均极显著降低，而cΔEnolase对DBMEC的黏附侵袭均有回补作用，且其相对入侵率与亲本株相比差异不显著，说明Enolase在RA-LZ01黏附和侵袭DBMEC过程中发挥重要作用。

为进一步验证enolase基因缺失后菌株在黏附和侵袭DBMEC中发生的表型改变，对樱桃谷雏鸭进行了攻毒试验，确定各菌株对雏鸭BBB的侵袭能力。试验结果发现，感染亲本株RA-LZ01、缺失株ΔEnolase及回复株cΔEnolase的雏鸭，其血液中的载菌量没有显著差异，说明enolase基因不影响菌株在雏鸭血液中的存活；但与感染亲本株和回复株的雏鸭相比，感染缺失株的雏鸭脑组织中的载菌量极显著下降，且雏鸭的精神状态相对较好，说明enolase基因缺失致弱了菌株入侵脑组织的能力，提示enolase基因在鸭疫里默氏杆菌突破BBB中发挥重要作用。