DNA甲基转移酶在急性髓系白血病中作用的研究进展*

姜慧慧，杨 新，弭苗苗，辛 钰，武洪远 综述，孙成铭△ 审校

1.青岛大学医学部，山东青岛 266000；2.青岛大学医学院附属烟台毓璜顶医院，山东烟台 264000；3.滨州医学院，山东烟台 264000

急性髓系白血病(AML)是来源于造血系统的髓系原始细胞恶性增殖性疾病，其发病率高、复发率高、预后差。大多数AML的病因不明，可能与高龄、吸烟、接触化学品、骨髓增殖性肿瘤、化疗药物、高剂量辐射暴露和家族史等危险因素有关[1]。近年研究显示，异常的表观遗传改变在AML发病过程中起重要作用，表观遗传改变主要包括DNA甲基化、组蛋白末端修饰和非编码RNA的变化，这些变化可以导致转录或转录后基因的沉默或激活，从而调控基因表达[2]。DNA甲基化是最具特征性的表观遗传修饰，在哺乳动物中，DNA甲基化通过转录调控以维持基因组稳定性、基因组印迹、X染色体失活等[3]。异常DNA甲基化与肿瘤的发生、发展密切相关，DNA低甲基化引起癌基因的过表达是癌症发生的重要原因，DNA高甲基化可导致关键的抑癌基因沉默，从而导致细胞生长失调或对癌症治疗反应改变。在健康造血干细胞中，表观遗传过程在细胞分化和造血过程中起关键作用。肿瘤基因组图谱显示，近44%的AML患者携带DNA甲基化相关的基因突变。DNA甲基转移酶(DNMT)是高度保守的DNA修饰酶，在正常造血过程中，DNMT在造血干细胞的自我更新和多系造血分化等过程中发挥重要作用，研究DNMT有助于揭示DNA甲基化参与AML发生的机制。哺乳动物有3种具有酶活性并负责参与DNA甲基化修饰的DNMT，即DNMT1、DNMT3A和DNMT3B。现就DNMT1、DNMT3A、DNMT3B在AML中的作用研究进展综述如下。

1 DNMT1在AML中的作用

DNMT1是细胞中含量最丰富的DNMT，因在细胞周期的S期高表达，所以成为癌症快速分裂细胞中甲基化抑制的特异性靶标[4]。DNMT1在AML中是一个潜在的癌蛋白，研究表明，抑制DNMT1表达后，癌细胞的增殖、侵袭和转移受到抑制，这主要是由于RAS相关结构域包含蛋白1(RASSF1A)和死亡相关蛋白激酶(DAPK)启动子的甲基化水平降低所致[5]。

1.1miRNA对DNMT1的调控作用 DNMT1是miRNA介导肿瘤进展的靶基因之一，并且DNMT1和miRNA之间可能存在着相互作用的表观遗传回路。miRNA异常上调或下调与恶性肿瘤的发生、发展有关。WANG等[6]报道，DNMT1在AML细胞系中受到miR-148a的负调控，DNMT1的抑制导致miR-148a启动子中5′-胞嘧啶-磷酸-鸟嘌呤-3′岛的甲基化水平降低，从而导致miR-148a表达升高，进而抑制细胞增殖并促进细胞凋亡。但有的miRNA并不直接靶向调控DNMT1，有研究报道，miR-29b可通过靶向其调控因子Sp1来间接下调DNMT1表达[7]。miRNA和DNMT1在AML中的关系和生物学功能仍有待阐明，在AML患者中验证这些结果仍需要进一步证实。

1.2DNMT1对抑癌基因p15的诱导作用 过表达的DNMT1可能通过诱导抑癌基因的高甲基化参与AML的发生、发展。DNMT1参与AML的一个关键致病机制就是通过介导p15INK4B的甲基化从而下调p15INK4B在AML中的表达[8]。MIZUNO等[9]的研究证实了具有甲基化p15INK4B的AML患者有表达更高水平DNMT1的趋势，并且启动子的高甲基化会导致疾病向更具侵袭性的表型转化。由于DNMT1经常通过作用于p15的启动子区域而下调p15的表达，因此，p15水平升高可作为衡量AML中DNMT1活性受损的指标。

1.3DNMT1与其他调节因子的相互作用 作为DNMT1基因表达的重要调节因子，核仁素的过表达常出现在癌症中，且其表达量与临床预后呈正相关。核仁素-核因子-κB(NF-κB)-DNMT1调节轴是导致AML发生的一条分子途径，这一过程中，核仁素直接激活NF-κB信号而上调DNMT1基因转录，进而发生DNA高甲基化。当核仁素失活会使NF-κB去磷酸化并抑制DNMT1的表达，从而降低了p15INK4B的整体甲基化水平，恢复p15INK4B的表达[10-11]，这为将核仁素作为AML的表观遗传治疗药物提供了有利的理论基础。另外，细胞脂肪酸结合蛋白4(FABP4)上调会通过增强依赖于DNMT1的DNA甲基化来促进AML的侵袭性。YAN等[10]的研究证明DNMT1能通过高活性的血管内皮生长因子信号反馈上调FABP4，利用选择性FABP4抑制剂BMS309403可逆转异常的DNA甲基化而重新激活沉默的p15INK4B，从而诱导AML细胞的分化。这表明FABP4可能是一种新的白血病药物候选分子，以FABP4-DNMT1轴为靶点是开发DNA去甲基化药物的新策略。

1.4蛋白激酶对DNMT的作用 不仅miRNA、NF-κB、核仁素、FABP4等是DNMT1基因表达的重要调节因子，蛋白激酶被发现也能够磷酸化和稳定DNMT1，导致DNMT活性增强[12]。随后有研究发现，在白血病细胞中，DNMT的表达与受体酪氨酸激酶(RTK)的表达呈正相关，RTK是DNMT1依赖的DNA甲基化的正调节因子。RTK功能障碍会降低DNMT表达，减少DNA甲基化，从而激活表观遗传沉默的p15INK4B，使白血病细胞的生长受到抑制[13]。这也为RTK抑制剂治疗白血病表观遗传异常提供了新的途径。总之，DNMT1是AML表观遗传治疗的一个潜在靶点。

2 DNMT3A在AML中的作用

DNMT3A在血液系统恶性肿瘤中的作用日益受到重视，大约20%的成人AML患者存在DNMT3A突变[14]。DNMT3A突变主要发生在第882位的精氨酸(R882)上，其中R882H最常见，占患者的70%～80%[15]。DNMT3A R882突变会导致患者呈现全基因组低甲基化状态，并且低甲基化主要发生在非CpG岛区域，这是因为DNMT3A R882突变通常以显性-负性方式作用于突变蛋白，突变蛋白干扰野生型DNMT3A形成活性四聚体的能力，抑制自身酶的活性，使DNMT3A突变患者呈现出全基因组的低甲基化状态[16]。

2.1DNMT3A突变与其他基因突变的协同作用 AML的分子突变之间通常存在相互作用的网络，因为DNMT3A突变本身可能不足以引起恶性肿瘤，而是需要额外的遗传扰动才能转化为白血病细胞。DNMT3A突变常常伴随着AML中其他基因的突变，如FLT3、NPM1、IDH1和IDH2[17]。在AML中，约30%的DNMT3A突变患者存在FLT3-ITD，约60%的DNMT3A突变患者存在NPM1突变[18]。YANG等[14]认为部分DNMT3A缺失会与FLT3-ITD协同作用，导致具有单核细胞和中性粒细胞偏向的AML，这也为DNMT3A突变与M4及M5的关联提供了依据。为证实DNMT3A突变与其他分子的协同作用，YANG等[14]还在具有FLT3-ITD过表达的DNMT3A基因敲除小鼠中进行功能研究后发现，该模型中造血干细胞获得DNMT3A突变，该突变会扩大并成为克隆扩张的储存库，直到获得另一个导致转化的遗传损伤如FLT3-ITD，进而转化为AML细胞。

2.2DNMT3A缺失损伤细胞功能 虽然DNMT3A的单一突变不会演变成白血病或者改变甲基化水平，但研究发现在小鼠模型中完全敲除DNMT3A也会产生抑制细胞分化等细胞功能的损伤，CHALLEN等[19]认为这主要是由于DNMT3A下游调控因子如Runx1、Gata3的上调，正常造血干细胞中Runx1和Gata3的过表达均会导致分化抑制。此外，DNMT3A的甲基转移酶活性是PML-RARα驱动的异常体外自我更新所必需的，并且DNMT3A对于Runx1-Runx1T1和MLL-AF9驱动的自我更新都是必不可少的[20-21]。可以说DNMT3A缺失可以诱发AML等血液疾病，但如果加入其他分子的协同作用后，可能诱发为更急性、凶险的恶性肿瘤。

2.3DNMT3A突变与预后不良相关 DNMT3A突变被普遍认为是AML不良预后的独立预测因子。有研究显示，DNMT3A突变患者的复发率明显高于未突变患者，总体生存期(OS)和无复发生存期(RFS)也明显短于未突变患者[22]。且有研究显示，许多接受化疗药物的AML患者在获得完全缓解(CR)后还仍然存在DNMT3A R882突变，这是因为突变可能发生在早期造血干细胞中，并与正常核型的AML有关，这种细胞在骨髓中分化为淋巴系和髓系，并进行克隆性扩增从而抑制正常造血干细胞[23]。甚至有的存在DNMT3A突变的AML患者，在CR时突变消失，但是在复发时又再次检测到突变[24]。这意味着DNMT3A突变可能是AML持续复发的重要因素，并且可能是监测微小残留病的潜在生物标志物。

3 DNMT3B在AML中的作用

与DNMT3A的高突变率相比，DNMT3B在血液系统恶性肿瘤中很少发生突变，研究者对DNMT3B突变的研究也比较少。有研究应用高分辨熔融分析(HRM)技术对137例AML患者DNMT3B的8～23外显子进行检测后并未发现突变，这提示DNMT3B在AML中不易发生突变[25]。但也有例外，有研究者在AML中发现了两个DNMT3B截短突变，一个( p.1622fs)发现于AML del(9q)患者，另一个(p.R571X)是在AML t(8；21)患者中发现，这两个突变被认为可能是AML发生的驱动因素[26]。

3.1DNMT3B与miRNA的相互作用 一些miRNA，包括miR-29a、miR-29b、miR-148a、miR-106a/b、miR-375和miR-147与DNMT3B的表达密切相关[26]。在所有相关的miRNA中，miR-29b最具特征性。miR-29b直接与DNMT3B的30个非翻译区相互作用，并下调其表达，从而导致高甲基化和沉默的p15INK4B在AML细胞中重新表达[27]。miR-375-Hoxb3-CDCA3/DNMT3B这个复杂的信号通路也被证实与AML的发生、发展密切相关，其中miR-375起着重要的基因表达调控因子的作用，Hoxb3-CDCA3/DNMT3B信号通路参与白血病的发生和维持[27]。如果抑制此信号通路可能恢复miR-375的表达以改善AML患者的治疗效果。

3.2DNMT3B过表达与预后不良相关 虽然DNMT3B突变在AML不常见，但是在正常核型的AML中，DNMT3B的过度表达可能是患者预后较差的分子生物学指标，并与较低的CR率、较短的无病生存期(DFS)和OS有关。2012年有研究报道了DNMT3B过度表达是AML患者生存不良的独立预测因子，分析了195例初治AML患者DNMT3A、DNMT3B的表达后得出结论，DNMT3B过表达与OS显著相关，与DFS呈负相关[24]。NIEDERWIESER等[28]对细胞遗传学正常的老年AML患者的多变量分析也证实DNMT3B高表达是较低CR率、较短DFS和OS的独立预测因子，但具体机制还有待研究。

3.3DNMT3B抑制肿瘤的进展 尽管有证据证实DNMT3B在AML中是一个潜在的癌蛋白，但有趣的是，有研究者发现DNMT3B在AML进展过程中还起着肿瘤抑制因子的作用[29]。ZHENG等[29]通过敲除小鼠MLL-AF9 AML白血病细胞中的DNMT3B，证明了DNMT3B缺失可通过增加干细胞和促进细胞周期进程来加速MLL-AF9 AML的进展。相反，DNMT3B在AML细胞中的过表达延长了AML受体的潜伏期，降低了急性髓系白血病干细胞(LSCs)的比例。因此，DNMT3B在AML进展过程中可能起着抑制肿瘤的作用，这也提示DNMT3B在功能上可能与其他DNMT不同，深入研究DNMT3B对AML的影响很有必要。

尽管对白血病的遗传学和表观遗传学研究取得了很大进展，但 AML仍是一种发病率高、复发率高、预后差的血液系统恶性肿瘤。DNA甲基化是重要的表观遗传机制，DNMT是DNA甲基化建立和维持所必需的酶，了解DNMT在AML发病机制中的作用对临床治疗具有重要意义。虽然表观遗传调节在AML的治疗中是有效的，但这些表观遗传治疗药物在体内的确切效果尚未得到详尽阐述，因此，对DNMT的深入研究对于推动该领域的发展至关重要，在该研究领域的进一步探索也将为AML的表观遗传疗法提供更多的靶向药物和治疗途径。