观赏园艺植物遗传图谱中分子标记技术的研究进展

蒋锦雷

（濮阳市农业农村局，河南 濮阳 457000）

分子标记在遗传学这门学科发展过程中有着至关重要的作用，同时也是观赏园艺植物遗传育种的重要工具。随着遗传学学科的纵深发展，遗传标记的种类和数量也在不断扩充，主要种类包括形态标记、细胞学标记、DNA 标记和生化标记4 类。其中DNA 标记是分子水平遗传变异的直接反映，而其他三类标记都是对基因的间接反映，并且对植物各发育阶段都能进行精准的分子鉴定，其数量丰富且结果可靠性高。

1 两大类分子标记技术原理和特点

DNA 分子标记是分子水平上遗传多态性的直接表现。生物技术的进步和科研成果的运用，为观赏植物遗传育种提供了基于DNA 多态性的分子标记，该技术的重要性早已被观赏植物育种领域所公认，其应用突出表现：直接以DNA 多态性形式表现，对观赏植物个体各个生长发育时期的细胞均可检测，不受时间、环境、取样部位等条件限制，且可覆盖到整个基因组[1]。鉴于多方面的优越性，现已大量地应用于观赏园艺植物分子育种研究[2]。

1.1 基于Southern技术类标记

该技术是利用限制性内切酶对各类DNA分子片段酶切后，用特异性探针进行Southern杂交技术，再通过放射自显影技术或非同位素显色来证明DNA分子的多态性。其中表现最典型的是发现最早的RFLP（restriction fragment length polymorphisms）标记，它属于共显性标记，呈孟德尔式遗传，结果稳定可靠，特别适合于建立连锁图谱，不足是RFLP探针的开发费用较高[3]。

1.2 基于PCR技术类分子标记

RAPD（random amplified polymorphic DNA）标记。设计的随机引物由10 个碱基组成，由该引物对样品的全基因组进行PCR 扩增，获得DNA 多态性条带。其具有分辨率高、简单、成本低等优点，因随机扩增基因组而致使其稳定性较差[4]。

SSR（simple sequence repeats）标记。该标记利用简单序列重复次数的差异设计引物，利用该引物一般检测到单一的多等位基因位点，而开发SSR 引物前期费用较高[5]。

AFLP（amplified fragments length polymorphism）标记。通过选择性扩增基因组DNA 的酶切片段，为共显性或显性，稳定性强，结果可靠[6]。

SRAP（sequence-related amplified polymorphism）标记。该标记利用基因外显子里GC 含量不同，同时启动子和内含子里AT 含量不同的特点来设计引物，利用该引物对不同材料的ORFs（open reading frames）进行扩增，扩增出多态DNA 条带，具有简便、稳定、便于克隆目标片段等特点[7]。

EST（expressed sequence tags）标记。该标记是通过对cDNA 文库随机扩增，进而对所得的cDNA 不同端序列进行测序，一般长度为150 bp～500 bp，易于开发[8]。

TRAP（target region amplified polymorphism）标记。该标记依据生物信息学及表达序列标签（EST）数据库DNA 信息，找出目标候选基因区，对照设计不同DNA标记[8]。

2 遗传图谱中常见分子标记技术的应用

1）RAPD 标记。Debener 等[9]通过运用305 个RAPD 分子标记、AFLP 分子标记构建了一张观赏植物玫瑰的连锁图谱。Peltier 等[10]利用RAPD 分子标记和形态学标记手段构建了一张观赏植物矮牵牛BC1群体的分子图谱，有7 个连锁群，覆盖基因组长262.9 cM，平均图距为8.2 cM。谢伟等[11]利用RAPD 分子标记对春兰、春剑、蕙兰进行了分子研究，构建它们的DNA 分子指纹图谱，并进一步探究了它们的亲缘关系。黄翠娟[12]利用RAPD、SSR 两种分子标记，以F1杂交群体为材料，构建了观赏植物梅花的分子图谱。黄少玲[13]利用RAPD 标记构建了一张春石斛分子遗传图谱，图谱包含9 个连锁群、121 个标记位点，其总长度为6 568.7 cM，标记间平均距离为50.11 cM。

2）SSR 标记。胡兴华等[14]以1 个茶花品种为试材研究不同体系，利用SSR 标记构建茶花分子指纹图谱。于超[15]以月季四倍体为材料，构建7 个连锁群，包含295 个多态性位点，总图距为874 cM，平均图距为2.9 cM。

3）ISSR 标记。缪恒彬等[16]利用ISSR 标记进行PCR 扩增，获得多态性谱带114 条，并利用标记多态性构建了菊花的指纹图谱。葛亚英等[17]利用12 条ISSR 引物，以41 个丽穗凤梨品种为材料，构建了丽穗凤梨品种的分子指纹图谱。

4）SRAP 标记。潘俊松等[18]以黄瓜自交系S06 与S52 杂交产生的F2群体（共93 个单株）为作图群体，应用SRAP 标记构建观赏黄瓜的分子遗传框架图谱。Gao 等[19]利用92 对SRAP 标记，以白姜花与圆瓣姜花杂交的F1个体为材料，构建两张中等密度的父母本的遗传图谱，其中母本连锁图有18 个连锁群，包含139 个标记，总长917 cM；父本的连锁图有23 个连锁群，包含203个标记，总长1 386.8 cM。Sun等[20]利用SRAP标记对梅花的图谱进行了连锁研究。

5）多种标记的综合应用。以下综述了常见的十种观赏园艺植物的分子图谱构建中多种分子标记的联合应用研究。Li 等[6]以羽衣甘蓝与花椰菜的86 个RI 系个体为作图群体，利用SRAP 标记、AFLP 标记作图，构建了羽衣甘蓝的分子图谱。Zhang 等[21]利用RAPD、ISSR 和AFLP 三种标记初步构建了菊花的遗传连锁图谱，共有567 个标记。张飞[22]以142 个F1为作图群体，利用RAPD、ISSR 和AFLP 三种标记，分别构建菊花父母本遗传图谱。Bossolini 等[23]以两个种间矮牵牛杂交个体为作图群体，运用SSR 标记、AFLP 标记构建了矮牵牛的分子图谱，图谱总长分别为970 cM和700 cM。潘宏兵[24]利用8个SSR标记、28个ISSR 标记和194 个SRAP 标记，构建了石斛遗传连锁图，该图谱有26 条连锁群，总图距为1 548.9 cM，平均图距为9.91 cM。王万兴[25]利用SSR、SNP 标记对结球甘蓝的DH 群体进行了遗传图谱构建，覆盖基因组总长度为1 197.9 cM，平均遗传距离和物理距离分别为0.98 cM 和503.3 Kb。唐楠[26]对郁金香的图谱研究表明，母本连锁群有27 条，包含110 个SNP 标记、2个SSR标记、238个AFLP标记，总图距为1 707 cM，平均图距为3.9 cM；父本连锁群有21 条，连锁群含有99 个SNP 标记、3 个SSR 标记、190 个AFLP 标记，总图距为1 201 cM，平均图距3.1 cM。Venkat 等[27]采用Anthurium ornatum“A1”和Anthurium“Eternity”杂交的41 个F1代单株用于遗传作图，共使用三种标记，其中有RAPD 标记99 个、ISSR 标记21 个和SRAP 标记108 个，对两个红掌亲本分别构建图谱，母本的图谱图距为1 233.5 cM，而父本的图谱总图距为1 023.5 cM。蔡长福[28]采用牡丹的F1代群体中195 株单株为作图群体，利用SLAF、SSR 标记，构建了牡丹的分子连锁图谱，该图谱总图距为1 061.94 cM，平均图距为0.84 cM。

3 存在的问题及展望

分子标记已经被广泛应用于遗传育种中。随着分子生物学的进一步发展，分子标记技术在观赏园艺植物育种领域的运用将更加广泛。但是现在大多数试验仅停留在少数几种标记技术的应用，在以后的研究中如果能把多种标记同时用在一个试验中，就会构建出饱和度更高的遗传图谱。SRAP 和TRAP 标记系统是简便、高效的标记系统，易于实现自动化，在一次实验中可产生大量的多态性片段。SRAP 标记可以和RAPD、AFLP 等其他分子标记相结合，构建大多数观赏园艺植物高度饱和的遗传图谱。大量筛选适用于观赏园艺植物花品种的SSR 标记，将是深入开展观赏园艺花品种指纹图谱研究必须应对的重要挑战。在与传统育种技术相结合的基础上，利用和开发更为高效的分子标记方法（例如EST-SSR 标记）成为观赏园艺植物标记育种研究的重点之一。