免疫分析技术在农药残留快速检测中的应用及研究进展

2023-01-03唐牧邵丹

农村科学实验 2022年12期

唐牧邵丹

（新疆石河子市疾病预防控制中心，新疆石河子 832000）

农作物中的农药残留会直接通过食物进入到人体内，在环境中残留的农药会被动地被植物吸附，然后通过食物链渐渐地进入到人体内。长期的农药残留会对人体健康带来负面影响，甚至直接破坏生态环境，影响到我国的出口经济，对中国社会发展也会造成巨大损失。为此，当前利用免疫分析技术对农药残留快速进行检测，能够帮助我国社会提高发展的整体速度。

1.免疫分析技术中抗原和抗体

在选择免疫分析技术时，首先要考虑到是抗原和抗体的制备技术。免疫分析技术一直以来都是以抗原、抗体的特异性结合作为基础，抗原、抗体的制备质量可谓是免疫分析过程中的关键和基础步骤。

1.1 抗原的制备

在进行抗原制备过程中，其主要是由于农药小分子与大分子物质发生反应。通过反应才能够激发动物产生抗体的产生，进而测量农药。但是在进行农药小分子测量过程中，需要确保小分子能够与大分子物质发生反应，具有活性基团，只有该基团能够始终保持着待测量物品的空间构型和电子分布半抗原，才能够确保在实际进行反应过程中，反应质量得到提升。在这个过程中需要考虑到理想的半抗原大多数情况下具备待测动物的结构特征。特别是待测动物的立体化学特征，而另外一方面理想半抗原与载体蛋白进行连接之后，能够保证半抗原特征结构最大限度地被免疫活性细胞识别和结合，同时也能够展现出抗原决定簇，更可以根据不同农药的实际需求，制备更加具有预期性和亲和性的抗体。包被原免疫原结构会对免疫分析特征性和灵敏性产生一定的影响，为此，在进行抗原的制备过程中，应做到针对一种分析目标，最好使用不同的半抗原以及不同的免疫检测方法进行检测，能够提高检测效果，同时也可以实现与载体蛋白的偶联，减少在免疫分析过程中存在的误差。做到桥与长臂的抗体与包被原的特异性结合，提高结合的质量并且增强免疫分析技术的特异性以及灵敏性。

1.2 抗体的制备

在抗体的制备过程中则需要考虑到不同阶段，分别是多克隆抗体阶段、单克隆抗体阶段以及基因工程抗体阶段。

分析多克隆抗体阶段时，应考虑到多克隆抗体阶段，主要是来源于免疫动物直接产生的，这是免疫分析过程中最简单并且应用时间长的一种抗体制备方法。单克隆抗体在进行制备的过程中，其主要利用的是免疫小鼠的脾细胞和骨髓瘤细胞进行融合，能够筛选出稳定分泌目标物抗体的细胞株，并且通过该细胞中进行开发。多克隆抗体和单克隆抗体相比较而言，单克隆抗体具有的独特优势在于可以无限量地去生产抗体，而多克隆抗体在使用过程中即便是针对同一只动物，由于采血的批次不同，动物中的抗血清存在着明显的差异性。根据近几年世界各地对于农药残留快速检测分析报告中进行分析，可以能发现单克隆抗体所占比例在逐年增加，但是无论是选择多克隆抗体的制备方式或是单克隆抗体的制备方式，其均存在着一个问题，就是所需要消耗的制备时间较长，并且费用较高，基因工程抗体工程应用的方式是利用DNA技术对其进行重组，通过基因突变以此来改造某一种抗体的基因序列编码，在自然界中可以制造出更多原本在自然界中不存在的蛋白质分子，通过重组抗体技术，例如噬菌体的显示发展，能够实现克隆生产抗体一目标，而这些片段本身具有完整的抗体功能，并且能够在生长繁殖迅速的大肠杆菌中进行表达，其直接缩短了制备抗体所需要消耗的时间。利在当前的基因抗体工程应用过程中最常见的抗体片段包括了。Scfv、fab与完整的LgG分子相比较而言，Scfv、fab片段本身的特异性更高，而重组抗体的存在不仅仅加速了不依赖于动物抗体的发展，同时在农药材料分析领域发展速度越来越快，并且得到良好的应用以及分析效果。

2.免疫分析技术在农药残留快速检测中的应用

2.1 化学发光免疫分析方法

在分析化学发光免疫分析方法时发现，其主要包括了以下两种不同的方式：

2.1.1 化学发光免疫分析法

化学发光免疫分析也称CLIA法，其主要的原理是利用在抗体或者是抗原上进行标记化学发光剂，进而形成的特异性免疫反应。在后续进行农药检测的过程中，其主要是通过获取已经完成标记的分子，对其进行化学发光反应，并分析在整个反应的过程中，所展现的化学发光强度，根据强度推断在本次样品中被标记抗体或者是抗原本身的含量。在实际检测的过程中，能发现其中包括的、常用的化学发光标记物为以下几种分别是：鲁米诺、异鲁米诺以及其衍生物、氨丁基乙基异鲁米诺、氨己基乙基异鲁米诺、邻苯三酚和吖啶酯类等等。

2.1.2 化学发光免疫分析法的优、缺点

在使用化学发光免疫分析法时，发现该方法具有以下几种不同的优点，分别是：第一，使用这种方式其检测的结果具有极强的准确性并且整体的精密度高，检测结果可以和放射免疫分析法即RIA相媲美；第二，化学发光免疫分析法灵敏度高，在使用的过程中，其反应速度较快，甚至超越RIA分析法；第三，整体消耗的检测时间较短；第四，在实验反应的过程中，所有使用的试剂均处于无毒性，并且整体的性质十分地稳定；第五，本次实验的过程中，可以在短时间内实现自动化测定；第六，该方法的适用性广。但是化学发光免疫分析法也存在一定的缺点，其中包括了以下几点：第一，抗原或者是抗体在被标记过发光物质后，会直接改变该物体的免疫反应性能，并且使用该发光剂进行标记的过程中，其标记率重现性较差。

2.1.3 化学发光酶联免疫分析法

化学发光酶联免疫分析法是基于传统的酶联免疫分析进行改进的一种方式，在传统的检测过程中，其酶的活性一般情况下是通过荧光法或催化光度法进行检测。但是随着时代的不断发展，近几年我国科学发展速度越来越快，人们开始选择利用化学发光反应法来检测酶的活性。从标记免疫测定方式进行分析，能发现在选择化学发光酶联免疫分析法即CLEIA，该方法本身属于酶免疫的测定范畴，在检测的工程中，其限低至10-17 mol／L，并且灵敏度较高，优于传统的放射免疫分析法。化学发光酶联免疫分析法与传统的酶联免疫分析相比，使用CLEIA法进行化学发光检测酶活性其并不是通过荧光法或催化光度法测定，能提高检测的整体效果和质量。除此之外，在检测的过程中，某些特殊的金属配合物可催化鲁米诺进行化学发光反应。外国学者Muhammad等人曾利用Co（Ⅱ）和Fe（Ⅱ）的配合物代替酶作为抗原（或者是抗体）的标记物，以此实现化学发光免疫分析，最终获得了成功。

2.1.4 化学发光免疫分析方法的发展趋势

近几年，我国的社会发展速度越来越快，其中化学发光免疫分析方法的发展速度同样加快，由于这种检测方式本身具有极强的优势。为此，在食品安全等各个不同的领域取得了广泛的应用优势，但是这种方法在应用过程中并不是完全没有缺点的，其中包括了以下几点：第一，选择该方式时，所使用的仪器体积较大；第二，在使用的过程中，样品本身的基质对方法的应用效果干扰大；第三，测定的小分子物质精密度较低。为了进一步发展该技术，需要明确其后续的研究方式，其中包括了以下几点：第一，改变仪器的大小，尽可能让仪器向着微型便捷化发展；第二，在样品处理之前，需要提高处理技术，使得处理技术达到更加高效，可以直接降低基质的干扰，增强该方法使用过程中的稳定性；第三，不断提高检测过程中的整体效率，促进CLIA技术向着多组分检测方向进行发展。

2.2 荧光免疫分析

2.2.1 荧光免疫分析技术的原理

荧光免疫分析是当前进行农药残留检测过程中常见的检测方法之一，这是由于荧光具有敏感可测性，能够与抗原、抗体进行免疫反应，并且能够实现高特异性有机结合，在抗体上标记荧光素作为跟踪器来标记抗体、抗原以及抗分子本身具有极强的合成性，能够提高检测的整体质量。当抗体抗原或抗反应结合物被荧光底物进行照射时，无论是蓝光或是紫光，照射底物都会存在吸收光照，进而转化成为激发态。激发态是一种不稳定的状态，其又会重回基态，而利用电磁辐射所释放出的一系列被吸收的光能会在这一阶段发出荧光信号，进而根据荧光的强度检测出农药的浓度曲线，被推断出该待测样品中所含有的农药残留量。

2.2.2 常见的荧光标记物类型

在使用荧光免疫分析技术时，需要了解到常见的荧光标记物类型有哪些，其中包括了以下几种：第一，香豆素类标记物。这一种标记物在使用的过程中，原理是利用底物标记的荧光酶联合免疫反应。在当前这一标记物使用得十分广泛，而其中最为典型的香豆素类标记物为伞形酮。第二，荧光素标记物。荧光素标记物在使用的过程中，其优势在于本身具有非常高的荧光量子产率，以及在进行反应过程中摩尔吸光系数较高，属于常见的荧光标记物，但是这一种标记物在使用的过程中存在着一个明显的缺点，就是荧光素的荧光发射光谱会直接与胆红素重叠，如果该检测物品中存在大量的胆红素，会对免疫反应产生极为严重的干扰。

2.2.3 均相荧光免疫分析

均相荧光免疫分析是指在抗体、抗原反应结束之后，对已经结合和没有结合的标记物，并不需要进行分离，可以直接进行测量，例如通过荧光的吸收，激发，淬灭等特性获得实验结果。当前均相荧光免疫分析技术使用的频率较高，而其中典型的分析方法如下：第一，利用荧光猝灭免疫分析，其中荧光素标记的抗原可以用作跟踪试剂，其中特异性抗体和被分析物与跟踪试剂结合后，并不会对跟踪器的荧光带来负面影响。在免疫反应结束之后加入荧光素抗体能够在第一时间内将游离太与试剂进行结合，在结合后则会实现荧光淬灭空间。但是由于空间阻碍会导致抗体结合过程中的跟踪剂无法完全结合荧光素抗体。为此，在使用这种方法时，荧光会随样品浓度增加而减弱，如果不考虑荧光猝灭的效率，在使用这一种方法时，其荧光信号会受到实际样品中固有的荧光干扰，整个过程中样品的检测和校验显得尤为重要。第二，荧光激发共振能量的免疫分析。

2.2.4 荧光免疫分析技术的发展前景

近几年荧光免疫分析技术发展速度迅速，其有效地弥补了传统免疫分析法中存在的灵敏度较差或是在定量时相对困难等一系列问题，但是荧光免疫分析技术在使用过程中也存在着一定的不足。例如，部分免疫过程其标记材料的信号强度和稳定性等有待改善。为此，为了进一步地提高荧光免疫分析技术的使用质量，需要做到以下几点：第一，不断地创新，并且发现更多新型的、成本相对较低的标记材料。第二，在拿到样品后，需要对样品进行前处理，提高药品前处理技术，并且降低干扰机制，提高运用过程中的准确性。第三，提高检测时的整体效率，能够促进荧光免疫分析技术，并且实现多组分的检测发展。第四，对荧光检测分析仪器进行改善，实现智能化发展，进一步提高检测过程以及检测质量，最终实现检测结果读取的智能化。

3.免疫分析技术在农药残留快速检测中的研究展望

3.1 研究中存在的缺陷

在近几年的发展过程中，针对农药残留快速检测这一工作内容，免疫分析技术已经成为极为重要的手段之一。但是免疫分析技术无论是在开发或是应用过程中都受到了一定的限制，这是由于在使用免疫分析技术时，其开发周期相对较长，并不是所有的农药分子都可以在当前选择免疫分析技术对其进行应用，部分没有特征结构的农药分子无法根据其农药状态设计半抗原，并且由于抗体本身存在的特异性，往往会出现假阳性的分析结果，直接误导检测人员，导致检测质量无法得到提升这一现象屡见不鲜。

3.2 研究方向

针对免疫分析存在的一系列缺点和不足，需要对免疫分析的未来发展方向进行探讨，其中包括了以下几点：第一，利用基因重组或者是基因突变的方法，能够有效地实现抗体改造，并且更好地对其载体进行沟通和建设，采用DNA免疫、细胞免疫等手段，能够制备出更多具有极强亲和力的抗体，逐步增加了免疫分析技术的整体质量，同时也能够缩短在整个免疫过程中所需要消耗的时间。第二，在多残留分析方面。有很多学者提出有部分小分子物质在进行免疫分析过程中，其存在交叉反应。为此，需要利用其反应过程中的分析物，以其代谢物的多残留进行分析，提高分析的整体效果，有效地解决免疫分析中多残留或者是由于反应物相同而导致的分析错误这一问题。利用蛋白芯片技术，但是蛋白芯片技术在我国食品分析中应用的时间相对较晚，近几年才渐渐地展现出其应用价值，具有极为良好的分析前景。