杏鲍菇副产物多糖超声提取工艺优化及其体外抗氧化活性研究

李 泉，潘少香，张青青，王文昌，刘雪梅*，李苗苗

（1.中华全国供销合作总社济南果品研究所，山东济南 250220；2.山东农业工程学院，山东济南 250100）

杏鲍菇，因兼具杏仁和鲍鱼的风味而得名，质厚爽口，脆嫩鲜美，是高蛋白低脂肪的食药两用健康食用菌。杏鲍菇产业规模仅次于金针菇，是全国第二大工业化生产食用菌品种，我国年生产总量接近160 万t，其中70%以上是工业化生产的杏鲍菇[1]。杏鲍菇副产物中富含糖类、含氮物质、矿物质等各种营养物质，重金属含量远低于国家安全标准的限量要求[2]，目前未见关于其存在食品安全问题的报道。

杏鲍菇在生产加工过程中产生的副产物较多，在工厂化栽培中产生的副产物约占成品菇产量的24%[3]，深加工产品种类少，商品的附加值较低。杏鲍菇副产物的直接废弃，造成了极大的资源浪费和环境污染，亟待研究其综合利用技术。已有研究将杏鲍菇副产物的生物活性物质提取再利用，作为食品原料加工制成面点产品、饮品、休闲食品，还能与肉类、面粉等原料进行搭配混合，研制出更有营养价值的复合制品，市场发展未来可期[4-6]。

杏鲍菇中富含食用菌多糖，占其总糖的50.29%[7]，具有降血糖[8]、降血脂[9-10]、免疫调节[11-12]、抗氧化[13]、抗病毒[14-15]等多种活性功能，是一种国内外公认的重要生物活性成分。目前植物多糖的提取方法有水浴提取法、酶法、亚临界法和超声提取法，传统多糖提取方法以热水提取法为主，提取时间长、效率低[16]。超声提取法利用超声波产生的空化作用和热效应，提高多糖溶解速度的同时，可有效保持生物活性。本研究采用超声辅助法提取杏鲍菇副产物中的多糖，优化提取工艺并对其体外抗氧化性做初步分析，以期为杏鲍菇副产物的综合利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 原料

本试验所用杏鲍菇副产物鲜品，包括菌脚、边角料和幼菇，来自于山东恒发食用菌有限公司。

1.2 试剂

无水乙醇，天津市富宇精细化工有限公司；葡萄糖，天津市致远化学试剂有限公司；结晶蒸馏抽提液、抗坏血酸，天津市科密欧化学试剂有限公司；硫酸，烟台远东精细化工有限公司；以上试剂均为分析纯。

1.3 仪器与设备

高速多功能粉碎机，SZ-500B，浙江锐腾食品机器有限公司；1P 空气能热泵柜式烘干机，DH-15HC 型，山东大琨能源科技有限公司；分析天平，MS304S，深圳市君达时代仪器有限公司；超声波清洗器，KQ-500E，昆山市超声仪器有限公司；医用离心机，Centrifuge-V，赛默飞世尔（苏州）仪器有限公司；电热恒温干燥箱，DHG-9202·0型，上海三发科学仪器有限公司；涡旋混合器，REAX-2000，海道尓夫仪器设备（上海）有限公司；紫外可见分光光度计，TU-1810，北京普析通用仪器有限责任公司。

1.4 试验方法

1.4.1 杏鲍菇副产物的预处理

取杏鲍菇鲜品的副产物包括菌脚、边角料和幼菇三类，分别切片后平铺于托盘上，放到热泵烘干机中55 ℃恒温烘干，用高速粉碎机粉碎成粉末后，过40 目筛，收集过筛粉末，备用。

1.4.2 超声法提取多糖

称取1.000 0 g 杏鲍菇副产物粉于离心管中，加适量的去离子水混合均匀，在500 W 功率下超声萃取一定时间，离心后取上清液与4 倍体积的无水乙醇混合，放入4 ℃冷藏醇沉，12 h 后取出，离心后将沉淀转移到烘干至恒质量的滤纸上，50 ℃真空恒温干燥得到杏鲍菇副产物粗多糖粉末。

1.4.3 超声法提取杏鲍菇副产物多糖工艺参数优化

（1）单因素试验

固定超声时间30 min、超声温度50 ℃，料液比1∶20（g/mL），改变其中一个因素进行单因素试验。料液比设置为1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35（g/mL），超声温度设置为30、40、50、60、70 ℃，在超声时间设置为10、20、30、40、50 min 进行超声提取、醇沉、复溶，测其吸光度值，进行3 次平行试验，以粗多糖含量为评价指标。

（2）响应面优化试验

在单因素试验的基础上，根据Box-Behnken 试验设计原理[17]，设置料液比（A）、超声温度（B）、超声时间（C）为响应面因子，以杏鲍菇副产物多糖含量为响应值，设计三因素三水平响应面分析试验，对杏鲍菇副产物多糖超声提取条件参数进行优化。响应面因子和水平见表1。

表1 响应面因子和水平表Table 1 Factors and levels and response surface

1.4.4 杏鲍菇副产物多糖含量的测定

（1）葡萄糖标准曲线的绘制

分别精密移取0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL 标准葡萄糖工作液（100 μg/mL）于10 mL 具塞试管中，加去离子水至1.0 mL 摇匀，加入1.00 mL 5%苯酚、5.00 mL 浓硫酸，充分混合后反应40 min，测定反应液在490 nm 的吸光度值。以葡萄糖质量浓度为横坐标，以吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。葡萄糖的标准曲线为y=0.004 1x-0.005 2（R2=0.999 1）。

（2）多糖含量的测定

将醇沉得到的烘干并冷却的杏鲍菇副产物粗多糖粉末转移至烧杯中，加一定量去离子水，经超声充分溶解后，定容于100 mL 容量瓶中，取上清液5.00 mL 定容至25 mL，摇匀后取2.00 mL 置于10 mL 具塞试管中，向其中加1.00 mL 5%苯酚、5.00 mL 浓硫酸，混合均匀后反应40 min，在490 nm 处测其吸光度值，空白试样加入2.00 mL 去离子水置于10 mL 具塞试管中，其余同样品操作。将测得的吸光度值代入标准曲线公式中计算杏鲍菇副产物中粗多糖质量浓度，单位以百分含量表示，多糖含量根据公式（1）计算。

式中，m1为从标准曲线上查得多糖提取液中的含糖量，μg；V1为多糖提取液定容体积，mL；V2为比色测定时所移取多糖提取液的体积，mL；m2为提取得到的杏鲍菇副产物粗多糖量，g；0.9 为葡萄糖换算成葡聚糖的校正系数；m为杏鲍菇副产物粉称样量，g。

1.4.5 粗多糖体外抗氧化活性研究

将提取得到的杏鲍菇副产物多糖粉末复溶后，配成0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL 的多糖溶液，分别移取4 mL于具塞刻度试管中，再向其中加入配制好的0.2 mmol/L的DPPH 溶液4.00 mL，充分混合后放入暗环境中反应30 min，经过离心后取上清液在517 nm 处测定反应溶液的吸光度值，记作A1，另取一只具塞试管加入4.00 mL 无水乙醇和4.00 mL 去离子水作为空白调零试样。阳性对照组是将1 mg/mL 维生素C 溶液配制成0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL 的溶液，其余处理步骤同杏鲍菇副产物粗多糖相同，测其吸光度A2。空白对照加入4.00 mL 去离子水和4.00 mL DPPH 溶液，其余处理步骤同杏鲍菇副产物粗多糖相同，测其吸光度A0。杏鲍菇副产物中粗多糖对DPPH 清除率按式（2）计算。

式中，A0为空白对照的吸光度值；Ai为不同质量浓度的样液吸光度值，i=1,2，A1为杏鲍菇多糖吸光度值，A2为维生素C 的吸光度值。

1.5 数据处理

数据采用DPS 9.0 软件处理。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 料液比对杏鲍菇副产物提取多糖含量的影响

由图1 可知，随着料液比的提高，杏鲍菇副产物多糖含量先增加后减少，在料液比为1∶20（g/mL）时达到峰值，为26.90%，与其他水平间均存在显著性差异（P＜0.05），1∶25、1∶30 之间无显著性差异（P＞0.05），1∶15、1∶35 之间也无显著性差异（P＞0.05）。说明在一定范围内增加溶剂体积能够有效促进杏鲍菇副产物中水溶性多糖的溶出，从而使得含量增加，但随着溶剂比例的继续增大，由于渗透压的改变[18]，其他水溶性成分也会一同溶出，从而降低多糖含量。同时液料比过大，后续沉淀消耗的乙醇量也会增加，造成浪费，也会增加多糖的损失，因此选择1∶20（g/mL）为最佳料液比。

图1 料液比对杏鲍菇副产物多糖含量的影响Fig.1 Effect of solid-liquid ratio on the content of polysaccharide in by-products of P. eryngii

2.1.2 超声温度对杏鲍菇副产物提取多糖含量的影响

由图2 可知，随着超声温度增加时，杏鲍菇副产物多糖含量先增加后减小，当超声温度为60 ℃时，达到最大值，此时多糖含量为24.07%，与其他水平间均存在显著性差异（P＜0.05），50 ℃和70 ℃之间无显著性差异（P＞0.05），30 ℃、40 ℃之间也无显著性差异（P＞0.05）。分析其原因可能是随着温度的升高，细胞中的分子运动加快，使得多糖浸出量增加，但如果萃取温度过高，可能引起多糖的分子结构被破坏，降低其萃取效率[19]。所以最佳超声温度为60 ℃。

图2 超声温度对杏鲍菇副产物多糖含量的影响Fig.2 Effect of ultrasonic temperature on the content of polysaccharide by-products of P. eryngii

2.1.3 超声时间对杏鲍菇副产物提取多糖含量的影响

由图3 可知，随着超声时间的延长，杏鲍菇副产物多糖提取含量也总体呈现先升高后下降的趋势，当超声时间为30 min 时，其最大含量为25.45%，与其他水平间均出现了显著性差异（P＜0.05）；当超声时间为50 min 时，出现了第二个峰值，其多糖含量为23.18%。分析原因是在一定范围内增加超声时间，能够有效破坏杏鲍菇细胞壁，利于多糖溶解在提取液中。在超声时间为40 min 时，杏鲍菇副产物中多糖的含量降低主要是因为超声的机械作用引起的。在超声时间为50 min 时发现多糖含量再次升高，这可能是在长时间超声作用下，导致杏鲍菇细胞中的其他长链物质分解为短链物质，从而提高了杏鲍菇副产物多糖的提取含量[20]。所以选定超声时间为30 min 为最佳工艺参数。

图3 超声时间对杏鲍菇副产物多糖含量的影响Fig.3 The effect of ultrasonic time on the content of polysaccharide in by-products of P. eryngii

2.2 响应面优化杏鲍菇多糖超声提取工艺参数结果

2.2.1 响应模型的建立与分析

为明确超声辅助提取杏鲍菇下脚料多糖工艺的最佳参数，基于单因素试验结果，采用Box-Behnken 的设计方法，响应面优化杏鲍菇多糖超声提取工艺参数结果如表2（见下页）所示，对17个实验点进行回归模型拟合，得到杏鲍菇下脚料多糖含量相关料液比（A）、超声温度（B）、超声时间（C）的回归模型方程为：杏鲍菇下脚料多糖含量（%）=28.60-0.50A-0.78B-0.090C+1.43AB-1.82AC-0.16BC-2.50A2-2.36B2-5.49C2。

表2 响应面结果Table 2 Response surface results

该公式的二次项系数都是负值，由此说明有最大值，可以进行最优解的求解。通过一次项系数的绝对值大小，可以推测出三种因素对多糖提取含量的影响程度，其中超声温度对杏鲍菇副产物多糖含量的影响最大，其次是料液比，超声时间影响较小。

2.2.2 响应模型的方差分析

由表3 可得，模型的F=116.99，其对应的P值＜0.000 1，说明模型的差异非常显著，具有统计学意义。失拟项P=0.553 1＞0.05，意味着失拟项相对于纯误差并不显著，无失拟项因子存在。R2=0.993 4（＞0.8），这表明所建立的模型具有很好的拟合性，且误差较小，与实际情况比较相符，可以用此回归公式来代替实测值。校正决定系数R2Adj为0.984 9（＞0.80）和变异系数（CV）为1.92%，表示此模型可说明98.49%的变化，因此能够做出准确的预测。

由表3 可看出，超声温度、料液比对杏鲍菇副产物中的多糖含量有明显的影响。通过对不同因子F、P值的分析，发现不同因素对杏鲍菇副产物多糖含量的影响由大到小的顺序为超声处理温度、料液比、超声处理时间。

表3 回归方程方差分析Table 3 Analysis of variance of regression equation

2.2.3 响应面交互作用分析

根据回归方程建立响应面曲线，结果如图4 所示。通过等高线图和3D 图可以分析响应面所选取的三个响应面因子两两之间对杏鲍菇副产物多糖含量的交互影响。从图4 可以看出，料液比和超声温度、料液比和超声时间以及超声温度和超声时间的等高线图是椭圆形的，表明各响应面因素两两之间彼此均有相互作用，结合响应面的倾斜程度和方差分析结果，发现料液比和超声处理温度、料液比和超声处理时间对杏鲍菇副产物多糖含量有显著的交互作用。

图4 各因素间对多糖含量影响的等高线图和3D 图Fig.4 Contour map and 3D map of the effect of various factors on polysaccharide content

2.2.4 响应面优化

通过软件分析，模拟出超声提取杏鲍菇副产物多糖的最佳工艺条件参数为：料液比1∶20（g/mL），超声提取温度57.82 ℃，超声提取时间30.24 min，杏鲍菇副产物多糖含量的预测值为28.73%，为保证实验的可操作性，超声最佳提取温度设为58℃，超声最佳提取时间设为30min。在此条件下进行3 次验证试验，得到实际多糖含量为29.06%，和预测值接近，说明该模型可用于拟合分析杏鲍菇副产物多糖提取工艺且效果较好，具有一定的应用价值。

2.3 杏鲍菇副产物多糖体外抗氧化活性研究

由图5 可看出，杏鲍菇副产物粗多糖质量浓度为1.0 mg/mL 时清除能力最强，与0.2、0.4、0.6 mg/mL 间均存在显著性差异（P＜0.05），略高于0.8 mg/mL 的杏鲍菇副产物多糖的清除率。维生素C 在0.6、0.8、1.0 mg/mL 的质量浓度的清除率无显著性差异（P＞0.05），但与0.2、0.4 mg/mL 之间存在显著性差异（P＜0.05）。在杏鲍菇副产物粗多糖提取液的浓度为0.2～0.8 mg/mL 时，杏鲍菇副产物中粗多糖对DPPH 的清除效果与多糖质量浓度成正线性相关（R2=0.955 9）。当粗多糖含量大于0.8 mg/mL时，对DPPH 自由基的抑制效果逐步稳定下来，在杏鲍菇副产物粗多糖提取液的浓度达到1.0 mg/mL 时，对自由基清除率可达56.96%。以维生素C 作为阳性对照，发现在杏鲍菇副产物粗多糖提取液的质量浓度为0.6 mg/mL时，对DPPH 自由基的抑制作用可达到维生素C 清除效果的53.93%。通过回归拟合，推测杏鲍菇副产物中的粗多糖对DPPH 的清除能力的IC50为0.700 mg/mL。

3 结论

杏鲍菇素有“平菇王”之称，其营养价值极高，富含杏鲍菇多糖等活性物质，可进行保鲜加工，是一种广受欢迎的食用菌。杏鲍菇下脚料中含有较高含量的杏鲍菇多糖，具有抗氧化、杀菌、抗病毒等多种功能。本论文采用超声辅助提取法从杏鲍菇下脚料中提取粗多糖，通过单因素与响应面试验优化设计，得到粗多糖提取的最佳工艺参数为料液比1∶20（g/mL），超声温度58 ℃，超声功率500 W，超声时间30 min，在此条件下，从杏鲍菇下脚料中提取的粗多糖含量达到29.06%。所提取的杏鲍菇粗多糖对DPPH 自由基的抑制作用的IC50为0.700 mg/mL，进一步证实了杏鲍菇下脚料中的多糖具有一定的抗氧化活性，为杏鲍菇可食副产物的后续处理及综合利用奠定理论基础。