循环肿瘤细胞体内短期动态的研究

高继伟，卜 歆，黄启科，赵华栋

(1空军军医大学唐都医院普通外科，陕西 西安 710038；2空军军医大学基础医学院生物化学与分子生物学教研室，陕西 西安 710032；3解放军第31681部队保障部，甘肃 天水 741022)

循环肿瘤细胞(circulating tumor cell，CTC)是指由肿瘤灶脱落进入血液循环的肿瘤细胞，被认为是肿瘤血道转移的根源。目前，CTC数目主要应用于预测转移性肿瘤患者预后，且已被部分指南推荐。患者体内CTC数目可通过抽取外周血进行检测获得，但应用此方法有两个默认前提，即CTC数目在短时间内不变且在外周血中充分混匀。然而，近年来有研究[1-6]发现CTC存在短期动态，既往绝大多数CTC研究在设计上并未考虑这一因素，抽血时间点较为宽泛，研究结果可能出现偏差。基于此，针对CTC短期动态的研究十分必要，本文主要从CTC基本特性、CTC短期动态模式以及CTC短期动态的相关问题三方面展开论述。

1 CTC基本特性

1.1 CTC的半衰期

CTC在体内的半衰期是CTC动态研究的基础问题，对这一问题的讨论有助于了解CTC在体内的稳定时间。MENG等[7]于2004年发表了关于乳腺癌患者体内CTC半衰期的临床研究，通过流式细胞仪，在术前、术后即刻、手术一段时间后分别对5名无转移的乳腺癌患者进行CTC检测。结果发现通过采用两种不同模型计算得出的患者CTC半衰期分别为1 h和2.4 h。由于临床研究受伦理制约，难以短时间从患者体内多次抽血进行研究，故此类研究多在动物体内进行。FITZGERALD等[8]利用活体漫反射流式细胞仪(diffuseinvivoflow cytometry，DiFC)研究了外源性Lewis肺癌细胞在小鼠血液循环中存在时间，发现其CTC半衰期约为1 h。由于在小鼠体内循环的肿瘤细胞是外源性的，故这种实验方法得出的结果可能有别于真实情况。同年，该团队在另一篇相关研究中对CTC的半衰期进行了总结：在临床研究方面，患者CTC半衰期为6 min～2.4 h；在动物研究中，根据不同肿瘤类型和小鼠品系，CTC半衰期为10～60 min[1]。因此，不论是临床患者还是小鼠，CTC半衰期范围从数分钟至数小时不等，这可能受研究对象体内物理和生理两方面因素影响。在物理方面，CTC可能在循环过程中受阻于体内微小血管，有人称其为“首过效应”[9]；在生理方面，免疫等因素可能导致CTC凋亡。

1.2 CTC的分布

通过外周血进行CTC检测的另一默认前提是：CTC在血液系统中充分混匀，即抽取的血液可以代表整个血液循环。然而，“首过效应”可能导致CTC在体内分布不均匀。针对此问题，JIAO等[10]在2009年发表的临床研究主要对比CTC在体循环和门体循环中的分布差异。该研究纳入11名进行开放直肠癌肝转移灶切除术的患者，在移除肿瘤前收集其血液样本，采集位点为外周静脉、外周动脉、门静脉、肝右静脉，并通过CellSearch系统检测CTC数目，CTC中位数范围依次为：1(0～3)，1(0～6)，87(0～500)，187(0～500)。由此可知，患者体循环中CTC数目显著少于门体循环。门静脉和肝静脉中的CTC在进入外周动、静脉之前，多数CTC可能被阻滞于肝和肺中。2014年，FANG等[11]发表的临床研究主要对比CTC在外周静脉与右心房内的分布差异。该研究纳入了42名肝细胞肝癌患者，在手术前3 min，分别从患者右心房和患者右肘正中静脉取血7.5 mL进行CTC检测，发现右心房的CTC阳性率和数目均高于外周静脉。TERAI等[12]于2015年发表的研究对比了CTC在患者外周静脉和外周动脉间的分布差异。该研究纳入了17名转移性葡萄膜黑色素瘤患者，从肘前静脉和股动脉采血并用CellSearch检测系统检测，发现CTC在外周动脉中的检出率和数目显著高于外周静脉。

综合上述研究，CTC在体内分布不均匀。CTC在通过微小循环后数目会大幅减少，符合血液在血管中的流动规律。除物理阻滞之外，CTC还可能通过血管内皮与其表面配体结合导致CTC的停留[13]。目前绝大多数检测方法从患者外周静脉取血，但其CTC数目较少。故临床医生在应用CTC检测时需要权衡患者创伤和CTC检出率。不同肿瘤类型根据其临床特点，最适宜的取血位置和检测方法可能不同。

2 CTC短期动态模式

根据上文对CTC半衰期和分布的论述，我们发现通过外周血进行CTC检测的两个默认前提均不准确，推测CTC在体内很可能不稳定。接下来我们总结了CTC短期动态的相关研究。目前还没有对CTC短期动态的定义，为方便下文叙述，本文将24 h内的CTC动态称为“日”间动态，将数小时内的CTC动态称为“时”间动态。“日”间动态和“时”间动态统称为短期动态。

2.1 CTC的“日”间动态

主要讨论CTC在1 d内的动态情况，但对其是否存在节律还没有一致结论。

2.1.1 CTC的“日”间动态无节律 2006年GARCA-SENZ等[2]对CTC的昼夜节律进行了临床研究。该研究纳入了23名多处转移的乳腺癌患者，在同一日08∶00和20∶00抽血检测患者CTC数目。CTC检测采用CellSearch系统，规定“CTC数目相差<5个或<30%”为无差异。结果显示：23名患者中，8人早晚检测结果有差异，13人无差异，2人检测结果无效。由此得出结论：未发现转移性乳腺癌患者体内CTC昼夜节律。该研究存在明显缺陷：①检测时间点过少且无重复，无法得出与昼夜节律相关的结论；②对CTC差异的规定没有依据。故该研究结果的可信性较低，但其是首篇对CTC日间规律进行的前瞻性临床研究，具有开创性。2009年，该研究组继续之前的研究并将样本量增至51例，同样未发现CTC的昼夜节律。他们认为同一日早晚CTC检测不会对结果带来影响[3]。

WILLIAMS等[1]于2020年发表了小鼠体内CTC日间变化情况的研究，利用DiFC系统对14只负荷多发性骨髓瘤细胞的重症联合免疫缺陷小鼠进行血管内CTC检测，在24 h内每间隔6 h检测1次，单次检测持续50 min。该研究未观察到任何特定的昼夜节律模式，CTC数目似乎在1 d中不同的时间随机升高或降低。

2.1.2 CTC的“日”间动态有节律 PAIVA等[4]在2013年发表的临床研究通过检测6名多发性骨髓瘤患者体内CTC情况来判断是否存在节律。所有检测从16∶00开始，每隔4 h检测1次，直至第2日12∶00。他们在5名患者中观察到了CTC的昼夜变化，并推测对于多发性骨髓瘤患者，CTC可能会在患者休息期间进入外周血以转移到骨髓中的其他位置。然而该研究存在缺陷：①样本量少；②该研究在CTC随时间变化图中通过重复首日16∶00的CTC数据来辅助读者观察节律，而没有实际检测，这很可能存在误导。但该研究也有一定价值：文中图示可以明确看出患者体内CTC数目在1 d中有很大波动。

2021年3月，ZHU等[5]发表了前列腺癌荷瘤小鼠体内CTC昼夜节律的研究。他们将BALB/c裸鼠分为4组：12/12 LD(正常周期：12 h明+12 h暗)、12/12 DL(反向周期：12 h暗+12 h明)、DD(持续黑暗，24 h暗)、16/8 LD(16 h明+8 h暗)。从首日08∶00到次日凌晨04∶00，每隔4 h用活体荧光流式细胞仪对小鼠耳部静脉进行30 min的体内CTC检测。结果如下：①12/12 LD组和DD组有相同的CTC动态周期，这说明小鼠CTC动态是内源性的。②12/12 DL组与12/12 LD组出现了完全相反的CTC动态周期；16/8 LD组与12/12 LD组相比，CTC动态周期恰好存在约4 h的移位。这一研究不仅发现了小鼠CTC的昼夜节律，还证明了光照是其关键影响因素。笔者从两方面对此进行解释：①物理方面，当小鼠在夜晚活动增强，可能会对肿瘤有更多的挤压，导致CTC数目上升。②生理方面，小鼠体内免疫随昼夜节律变化。小鼠休息时，体内自然杀伤细胞数目上升，可能导致CTC数目下降。

该研究结果与WILLIAMS等[1]的研究结果不一致。之后，两研究团队以刊发评论的方式对研究结果的差异进行了讨论。WILLIAMS等[14]提出：两个研究团队在实验方法上近似，但其团队未发现任何CTC节律。对此ZHU等[15]表示研究结果差异可能由两方面原因造成：①肿瘤类型不同。WILLIAMS等研究多发性骨髓瘤，是血液系统肿瘤，而ZHU等研究前列腺癌肿瘤，是实体瘤，这两种肿瘤类型在肿瘤微环境方面有很多差异；②小鼠类型不同。WILLIAMS等使用的是联合免疫缺陷小鼠，ZHU等使用的是T细胞免疫缺陷小鼠。众所周知，骨髓中免疫细胞和细胞因子表现出显著的昼夜节律。推测WILLIAMS等使用的小鼠可能缺失了这种免疫相关的昼夜节律。若此推测成立，免疫功能在CTC动态中的地位将十分重要。

综上所述，不论是临床试验还是动物研究，均发现CTC的确存在“日”间动态，但是否存在节律仍无定论。目前，在动物研究层面，实验设计和实施比较完善，但也有难以克服的缺陷：①实验动物的免疫都存在不同程度的缺陷；②研究的肿瘤类型各异。而临床试验的共同缺陷是：①患者样本量过少；②肿瘤类型不一致；③日间抽血次数不能满足研究需求。目前还未发现研究设计完善的临床试验，故无法在临床层面得出患者CTC是否存在节律性变化的结论。

2.2 CTC的“时”间动态

为了研究CTC更短时间段内的动态情况，我们将CTC研究的时间段从“日”细化到“时”。针对这一问题的研究多采用活体CTC持续检测的方法，这种方法在动物实验中较为成熟，但目前可用于临床的CTC活体检测方法极少。

JURATLI等[6]在2014年的研究纳入了7例 Ⅳ 期黑色素瘤患者，用同1只注射器连续采血9 mL，并等分成3份3 mL血液样本，使用磁性细胞分选进行CTC检测。结果发现每份样本检测出的CTC数目均不同，有的患者甚至只在3份样本中的1份样本中检测到CTC。按照人体血容量(5 L)换算，晚期黑色素瘤患者体内最多0.12%血容量(peripheral blood volume，PBV)的外周血中无CTC的存在。该团队在动物实验中也发现了荷瘤小鼠血液中存在无法检测到CTC的时间段[6]。研究人员通过荧光流式细胞仪连续检测乳腺癌荷瘤裸鼠耳部血管内CTC情况。在小鼠荷瘤2周时，血液中CTC数目较少。在连续150 min的检测中发现无CTC的最长时间为25 min。根据换算，约为0.45% PBV。在小鼠荷瘤5周时，血液中CTC数目是荷瘤2周时的近20倍。此时在连续检测中仍能发现约0.09% PBV中无法检测到CTC。WILLIAMS等[1]在2020年发表的文章也对此问题进行了研究。该团队使用DiFC技术对多发性骨髓瘤小鼠模型血管进行35 min的连续检测，结果发现：与35 min检测的平均值相比，检测时间越短，CTC的准确性越低。

综上所述，我们再次在临床研究和动物实验中得出了相同的结论：在数分钟或数小时的时间段内，CTC仍会出现动态波动，这种动态存在于肿瘤各阶段。笔者认为，研究CTC动态的时间范围越短，CTC动态越可以运用流体物理学(血管直径、血流速度等)解释；所研究的时间范围越长，生物生理学因素(肿瘤生物学行为、机体免疫清除功能等)的影响越大，这两方面因素共同对CTC短期动态变化作出解释。

3 CTC短期动态相关问题

3.1 CTC短期动态与长期变化的关系

通过前文的论述，我们基本可以确定不论是动物还是临床患者，体内均存在CTC短期动态。其是否会影响CTC检测在预后预测中的效力是我们需要考虑的问题。

肿瘤的生长是一个较为长期的过程，即使在荷瘤小鼠体内，肿瘤进展也不适宜以“日”为单位记录。有研究发现，小鼠体内CTC数目与肿瘤体积和肿瘤灶中血管密度呈正相关[16]。因此，即使CTC存在短期动态，这种动态仍受限于肿瘤灶。此外，CTC的短期动态可能与物理压迫和生理节律有关，均为短期因素；而肿瘤生长是肿瘤与机体缓慢形成新平衡的过程，它们的影响因素也不一致。综上所述，虽然CTC在体内存在短期动态，但这种动态仍受限于肿瘤灶实体。CTC的短期动态不会从根本上影响疾病进展过程中的CTC数目趋势。在以往的研究中，CTC短期动态可能在大样本研究中被稀释。针对CTC短期动态的研究是为了更准确地研究CTC在人体中的情况，为CTC临床应用提供理论支持。

3.2 CTC单次检测的可信性

WILLIAMS等[1]在动物研究中发现：单次常规样本量CTC检测结果不能很好地代表当日CTC动态的均值。ACETO[17]在2019年发表的评论中对临床CTC阴性结果的意义进行了探讨。该评论提出，患者1次CTC检测为阴性不能完全认为其体内无CTC，原因是：①CTC的释放可能是间歇的而不是持续的；②肿瘤灶释放的CTC因首过效应而在外周血中缺失；③即使存在转移，也不清楚转移灶释放CTC的能力。此外，JURATLI等[6]在动物实验中发现：肿瘤早期CTC数目较少，且无CTC血流时间较肿瘤晚期更长。综上，我们认为单次CTC检测结果准确性可能不够理想。同时，临床医生对CTC阴性结果的解读需格外谨慎。

3.3 提高CTC检测准确性的方法

由于CTC存在短期动态，可能出现CTC短暂缺失和数目波动较大的情况。故提高CTC检测的准确性十分必要，我们建议通过以下两种方法提高CTC检测的准确性。

3.3.1 增加采血量 在肿瘤早期，实际观察到无CTC的PBV可达1.40%。在肿瘤晚期，无CTC的PBV也达到0.09%[6]。CellSearch检测系统需要的7.5 mL外周血仅占0.15% PBV，现有检测技术所需的采血量更少。由此可以推测采血量不足可能是导致CTC检测不准确的重要原因。

LALMAHOMED等[18]在2010年提出的“The more，the better”理论，目前仍有借鉴意义。他们对比了同批患者7.5 mL和30.0 mL血液样本检测到的CTC数目，提出了较为激进的建议：对结直肠癌肝转移患者抽取30.0 mL外周血可能会为其带来更多潜在受益。

当前，根据指南在临床上应用CTC检测，获益的患者群体很局限。研究者在早期肿瘤患者中也发现了CTC的预后预测能力[19-22]，但这又会面临CTC数目较少的情况。研究人员可结合患者肿瘤类型及肿瘤阶段挑选有效的CTC检测方法，在平衡抽血量对患者的损伤与患者获益后，逐步摸索出合适的抽血量。笔者认为，目前研究人员不应执着于降低患者抽血量而牺牲CTC检测的准确性，这一做法反而可能会对患者预后不利。

3.3.2 间隔多次采样 增大单次采血量可以减少CTC短暂缺失带来的偏差，但无法改善CTC“日”间动态带来的偏差，是否存在其他可行的方式是接下来讨论的重点。

WILLIAMS等[1]在2020年发表的研究对比了单次不同PBV和间隔多次采样对CTC检测结果的影响。结果发现在24 h内，多个小样本的平均值比单个大样本CTC检测准确性更高。ZHU等[5]在2021年发表的文章与上文的研究方法类似，只是PBV的选择方式不同，但同样发现通过更多的血液样本和多次取样均可以提高CTC检测的准确性。以上两个研究为临床研究提供了“间隔多次取样”以提升CTC检测准确性的策略。但以上研究均为动物实验，能否直接应用于临床还需要验证。

4 结语

尽管CTC的临床应用还处于早期阶段，但其对于肿瘤预后预测和辅助治疗的价值不可否认。CTC检测若能广泛应用于肿瘤患者，会为肿瘤治疗带来新的突破。例如，肿瘤术后患者CTC监测发现异常，可以在转移灶不可见时通过新型辅助治疗策略进行干预，提高患者生存期。或者，用CTC结果替代现有的临床观察终点，缩短较长的随访时间、减少临床试验的巨大成本[23]。

另外，通过外周血的CTC检测技术在检出率等方面已接近上限，很难再有突破。结合患者CTC的短期动态，可应用于临床的活体CTC检测技术可能是一个有前景的领域。针对动物研究已有很成熟的CTC活体检测方法，原理多是在体外透过血管检测带有荧光标记的外源性肿瘤细胞，但这一原理不适用于临床。目前已有针对黑色素瘤患者的活体CTC检测平台Cytophone[24]，但其利用的是黑色素的物理特性，不能满足其他类型肿瘤患者的CTC检测需求。若能出现技术突破，“CTC透析”等抗CTC治疗可能成为新的治疗方式。CTC的短期动态是对现有CTC理论的补充，对此问题的研究不仅有助于规范CTC的临床应用，还能够为之后相关研究提供理论依据。