MALDI-TOF MS在临床微生物检验中的应用进展 ①

李 萌，罗美玲

( 广西医科大学第一附属医院检验科，广西 南宁 530021)

质谱(mass spectrometry)是一种利用离子化技术将原本不带电荷的物质先转化为带电荷的离子，再按照各种离子质核比的差异进行分离测定，从而确定待测物中离子种类和含量的方法，广泛地应用于生物、化学、环境、医学等领域。基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(matrix assisted laser desorption/ ionization time-of-flight mass spectrometry，MALDI-TOF MS)针对临床微生物检验的需求进行了相应调整与优化，是目前临床微生物实验室中应用最为广泛的质谱技术[1]。

1 MALDI-TOF MS的原理

传统的细菌/真菌的检查与鉴定方法存在操作繁琐，耗时较长，试验结果不稳定等缺点，导致难以对某些疑难病原微生物做出准确而及时的检查与鉴定[2]，影响临床患者的治疗。MALDI-TOF MS是一种基于微生物蛋白质指纹图谱分析的技术，其主要原理是先提取未知微生物蛋白质分子，并利用合适的基质与上述蛋白质分子形成共结晶，在激光照射下使原本不带电的蛋白质分子电离带上电荷，然后在电场作用下通过一个真空管道移动(飞行)至检测器。由于不同质荷比(m/z)的离子抵达检测器的先后顺序不尽相同，便可获得特异性的蛋白质指纹图谱，再通过各种算法分析图谱峰型数据，并与数据库中的已知微生物蛋白指纹图谱进行比对，从而确定该未知微生物的种类。

2 MALDI-TOF MS在细菌/真菌检测与鉴定中的应用

与传统方法相比，MALDI-TOF MS具有快速、简便、精确等优势，鉴定时间可压缩至15～60 min之内[3-5]，同时准确性达到了新的高度。如Sogawa等[6]利用MALDI-TOF MS对92种共计468株细菌进行了测试，91.7%的菌株被准确鉴定到种，97.0%的细菌被准确鉴定到属。而在Faron等[7]在一项多中心研究中报告，2263株细菌(共计61种)被准确鉴定到98.2%的种水平及99.8%的属水平。在真菌鉴定方面，Sendid等[8]使用MALDI-TOF MS与基于生物化学的传统真菌鉴定方法进行了比对，在临床常见的28种1207株酵母菌中，MALDI-TOF MS鉴定准确率为97.5%，略高于生物化学法(97.1%)，且时间更短，成本更低。对于丝状真菌而言，MALDI-TOF MS也能取得很好的鉴定效果，如Mcmullen等[9]利用升级后的商业数据库对144株曲霉菌进行了鉴定，结果93.6%(133/144)的菌株被准确鉴定到了种水平。

对于临床上某些罕见的病原体，比如非结核分枝杆菌(NTM)和诺卡菌等，如果按照传统的表型鉴定方法鉴定菌种，不仅操作繁琐，且耗时较长。MALDI-TOF MS的出现，给上述病原体的准确鉴定提供了新的选择。Rodriguez-Temporal等[10]的研究纳入了临床分离到的67种共计1453株非结核分枝杆菌，MALDI-TOF MS成功鉴定出了其中的64种，准确率为95.5%。该研究者还进一步指出，当检测得分不小于1.60分(scores ≥1.60)时，大部分种类的NTM均鉴定正确，这为质谱检测NTM阈值分数的设定范围提供了依据。王蔚等[11]的研究也证实，液体培养的NTM，包括堪萨斯分枝杆菌和脓肿分枝杆菌在内，其MALDI-TOF MS正确鉴定率达到88.46%(69/78)。而对于诺卡菌来说，完善的数据库及适当的前处理可能会对正确鉴定产生一定的影响。Buckwalter等[12]曾使用了自建数据库与商业数据库相结合的模式，使鉴定准确率从原来的42%提高到了90%。王鹏等[13]通过改进样本前处理方式，将46株诺卡菌的种水平鉴定率从84.8%提高到了93.5%(43/46)。

3 MALDI-TOF MS在细菌分型方面的应用

细菌分型对于聚集性感染暴发的监测至关重要。既有的分子生物学方法，如多位点序列分型(multi locus sequence typing，MLST)及脉冲场凝胶电泳(pulse field gel electrophoresis，PFGE)，在细菌分型方面发挥了强大的作用，但也存在设备昂贵、操作繁琐、耗时较长、适用性不强等缺点[14]。为了寻求简便快速、成本低廉的新方法，不少学者利用MALDI-TOF MS高解析度的特点，在细菌分型方面做了尝试。

大肠埃希菌被分为几个系统群，A群和B1群与非致病性定植有关，而B2群和D群与肠外疾病有关[15]，其中ST131亚群被认为与医院感染密切相关[16]。Egli等[17]使用MALDI-TOF MS和PFGE同时对产超广谱β-内酰胺酶的大肠埃希菌进行分析，发现前者快速简便，且结果与PFGE一样可靠。Nakamura等[18]发现指纹图谱在7650m/z及7707m/z形成的特征性峰型可将大肠埃希菌ST131亚群与其他亚群相区分。彭海等[19]也证实了MALDI-TOF MS对于多重耐药的大肠埃希菌同源性聚类分析具有较好的潜力。

金黄色葡萄球菌是临床微生物实验室中最常见的分离菌之一，具有多种不同的耐药机制，耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌(MRSA)不但耐药性强，而且也是院内感染的重要来源[20]。Lindgren等[21]先将111株已知PFGE分型的MRSA使用MALDI-TOF MS制成超级图谱，再利用该超级图谱进行其它待测MRSA的分型，结果显示67.4%的待测MRSA分型与PFGE一致。Steensels等[22]尝试MALDI-TOF MS对新生儿ICU内暴发的MRSA进行直接分型，发现分型结果与PFGE符合率为93%(14/15)，但重复性较差。郭坤山等[23]分析了80株金黄色葡萄球菌临床分离株，发现质荷比为6812 m/z、7594 m/z和11990 m/z的蛋白峰是区分MRSA和MSSA最主要的特征性峰型，可用于MRSA的快速筛查。

4 MALDI-TOF MS在抗生素耐药性快速检测方面的应用

自1928年弗莱明发现青霉素以来，随着抗生素的大规模使用，细菌对抗生素的耐药性也与日俱增。抗生素耐药性检测是临床微生物实验室日常主要工作之一，常规的耐药性检测方法有纸片法、稀释法、E-test等，然而上述方法均需要6 h以上的检测时间，有时不能满足尽早开始针对性治疗的需求，为此不少学者开始着眼于MALDI-TOF MS快速价廉的优势，尝试利用该技术进行抗生素耐药性的快速检测，目前主要的应用方向包括以下几个方面。

4.1 基于图谱特征的快速检测

某些细菌产生耐药性之后，由于其表达的蛋白也同时发生了变化，在MALDI-TOF MS检测图谱中会体现出某些特定蛋白峰的出现、消失，峰强度(峰高)的变化以及峰坐标位置的改变等特征[24]。这些特征可被特定软件发现并提取出来，并以此构建出专门针对该种耐药菌株的自建数据库。将样本菌株得到的质谱图谱与该自建数据库进行比对，即可快速判定该样本菌株是否属于相同耐药表型[25]。如Centonze等[26]证实，在99.4%(175/176)的产KPC菌株质谱图谱中存在特异性的11109±8 m/z的蛋白峰，而对照组均缺乏该峰，灵敏度(98.7%)和特异性(100%)均较高；林晓晖等[27]也发现，3853 m/z、4218m/z、4619m/z是用于判定肺炎链球菌是否对青霉素敏感的3个最主要的特征峰。

4.2 基于抗生素分解的快速检测

某些细菌产生的酶能够将特定抗生素分解为分子量更小的产物。把待测菌株接种于含有特定抗生素的培养基中孵育一段时间后，如果该菌株能够产生相应的酶，那么抗生素就会被其水解，残留抗生素及其水解产物的存在会导致反应前后MALDI-TOF MS检测图谱峰型发生改变，通过对峰型的分析可以判断是否存在相应的酶，据此间接推断待测菌株的耐药性[28]。如Kost等[29]评估了MALDI-TOF MS对于碳青霉烯耐药的肠杆菌(CRE)的检测能力，厄他培南耐药的检出率为92.7%(89/96)，亚胺培南耐药的检出率为97.9%(94/96)； Sakarikou等[30]使用MALDI-TOF MS对55株来自血培养中的肺炎克雷伯菌进行了厄他培南的水解产物检测，发现MALDI-TOF MS可以检测并区分不同的产酶菌株，且结果与传统药敏试验和基因型鉴定完全一致；李翔等[31]研究也指出，MALDI-TOF MS与传统药敏试验及PCR的检测效能差异无统计学意义(P>0.05)，但前者可大幅缩短检测时间。

4.3 基于生长特性的快速检测

细菌或真菌在各个生长阶段表达的蛋白具有一定差异性，将待测菌株置于含有梯度浓度抗生素的培养基中，待测菌株受到不同梯度浓度抗生素的抑制，其在相应培养基中的生长特性不同，蛋白表达也不同，利用MALDI-TOF MS检测各个培养基中的蛋白峰型，利用数学模型计算出综合相关指数(composite correlation index，CCI)，可以快速判断待测菌株是否对该抗生素耐药[32]。如Vella等[33]利用上述方法，将白色念珠菌对棘白菌素抗真菌药物的敏感性判断时间由原来的24 ～ 48 h压缩至3 h。Sparbier等[34]对上述方法进行了改进，不再使用CCI，而是使用MALDI-TOF MS直接逐一检测各培养基中的质谱图谱，再通过内标、峰值强度与检测数值共同计算相对微生物含量，从而判定最小抑菌浓度。Van等[35]对100株多杀巴斯德菌使用上述方法进行耐药性快速检测，敏感性和特异性分别为95.7%和100%。

目前，培养与鉴定仍然是临床上诊断细菌或真菌感染的金标准，但传统的表型或生化鉴定方法耗时较长，有时难以满足对病原体尤其是危重症感染病原体快速诊断的需求。MALDI-TOF MS的出现，缩短了检测时间，优化了工作流程，且提高了临床微生物实验室对于罕见菌、疑难菌、苛养菌、厌氧菌等的鉴定能力。相信未来MALDI-TOF MS的发展重心将是数据库的不断扩充与完善，特定软件的研发与优化，从而拓展以菌株鉴定与分型为核心功能相关的应用场景。

另一方面，不少学者尝试利用MALDI-TOF MS进行抗生素耐药性的快速检测试验，虽然检测方法缺乏标准化，但目前的研究已显示其具有优秀的潜力，未来的研究将会朝着简便化、标准化、自动化的方向推进，使其接近甚至达到传统耐药性检测方法的水准，能够精准及时地为临床用药提供有力支持。随着研究的深入进展，MALDI-TOF MS将给临床微生物实验室带来新的革命。