外泌体在毛乳头细胞诱导毛发再生中的作用 ①

曹贵媛，祝宁侠

(桂林医学院，广西 桂林 541199)

随着生活方式的改变和工作压力的增加，脱发性疾病在人群中发病率逐渐升高，缺乏高效治疗手段，严重影响患者形象和生理健康，降低生活质量。毛囊是活性微小型器官，由间质和上皮成分构成，其生长周期分为生长期、退行期和休止期三个阶段，各周期功能状态与脱发性疾病的发生密切相关[1]。毛乳头(dermal papilla，DP)细胞作为毛囊单位的主要间充质成分，在维持毛发生长和诱导毛囊再生中发挥重要调节作用[1]。雄激素性脱发(androgenic alopecia，AGA)是临床上最常见的脱发病理类型，研究人员从AGA患者头皮分离的DP细胞中检测到高水平的雄激素受体，并认为DP细胞诱导功能丢失导致了AGA发生[2]。因而维持DP细胞诱导毛发再生功能，成为了治疗脱发性疾病的关键。外泌体(exosomes)由各种细胞分泌，包含蛋白质、脂质和miRNA等物质，在细胞间通信中发挥重要的作用。近年来研究发现外泌体具有维持DP细胞毛发诱导能力，为脱发类疾病的研究提供了新的方向。本文通过对国内外文献的整理，对DP细胞诱导维持毛发再生机制及几种细胞来源的外泌体在毛发再生中的作用进行综述，期望为脱发类疾病的实验研究和临床治疗提供思路。

1 DP细胞结构和功能

在早期毛囊发育过程中，单层上皮细胞接收来自真皮细胞的“第一真皮信号”Wnt后，增厚、局部形成毛囊基板并诱导下方的真皮细胞聚集成团；随后毛囊基板收到由Wnt5a介导的“第二真皮信号”Shh，诱导上皮细胞向下生长增殖，形成毛母质细胞。毛母质细胞在多次增殖的过程中逐渐包裹聚集细胞团，并向上生长、分化为毛干和内根鞘，毛母质细胞包裹的细胞团逐渐发育成成熟的毛乳头[3]。DP细胞位于毛囊底部，其通过与毛囊干细胞相互作用，在胚胎时期中毛囊的形成以及出生后毛囊周期性生长过程中扮演重要角色，机制与Wnt等多种信号通路相关[3-4]。研究表明，DP细胞通过分泌miR-22-5p靶向调控Wnt信号通路关键因子LEF-1，抑制毛囊干细胞增殖和分化，阻滞毛囊周期[4]。研究者提取AGA患者“秃发区”和“非秃发区”DP细胞进行培养，发现“秃发区”DP细胞更早呈现衰老表型，丢失毛囊诱导功能[5]。目前，脱发治疗方法主要有药物和毛囊单位移植，存在副作用及供体有限等问题[6]。因此，维持或恢复DP细胞毛发诱导能力因子的探索成为脱发治疗研究的关注点。

2 外泌体的生物特性及其功能

细胞主动释放且具有膜结构的囊泡统称为细胞外囊泡，基于大小和生物物理性质可进一步分为外泌体、凋亡小体和微囊泡等。研究表明，外泌体与细胞外囊泡在大小、膜定位等方面具有相似的生物物理特征[7]。在1893年，Pan等[8]在绵羊网织红细胞中首次发现外泌体，其为一种直径约30～150 nm的膜结合纳米囊泡，密度为1.11～1.19 g/ml，典型标志物为CD9、CD63和CD81[9]。随后，研究者发现此类细胞外囊泡并不是细胞废弃物，它能够将信号传递给其他细胞，从而进行细胞间交流[10]。外泌体形成早期表现为细胞膜内陷，将一些细胞外成分(蛋白质、miRNA和脂质等)包裹进胞内，形成早期内涵体；而后早期内涵体经高尔基体作用融合成晚期内涵体，最终形成含有腔内囊泡的细胞内多膜体；这些细胞内多膜体释放到细胞外形成外泌体，被靶细胞吸收后通过物质交换或释放胞内物质实现信息交流[10]。

大量聚焦外泌体的研究已经发现干细胞、脂肪细胞和肿瘤细胞等都可以释放外泌体，对多种生理和疾病病理发展过程有重大影响[10]。人诱导多能干细胞衍生的神经元外泌体，能促进神经细胞增殖，影响轴突的形成和形态发生[11]。在2型糖尿病中，脂肪细胞来源的外泌体通过传递miRNA和蛋白质等，调节胰岛素敏感性，改善2型糖尿病症状[12]。靶向神经退行性疾病的研究表明，外泌体可干预细胞内毒性蛋白质的累积，缓解阿尔茨海默症相关症状[13]。由于外泌体包含各种物质，如miRNA、脂质和DNA片段等，对外泌体内容物的检测可作为不同肿瘤细胞的早期诊断潜在的重要选择[14]。Zeng等[15]的研究发现，结直肠癌细胞通过衍生的外泌体将肿瘤转移促进因子miR-25-3P输送至血管内皮细胞，增加血管通透性和血管生成，并结合临床数据提出外泌体miR-25-3P的定量检测能够早期识别患者肿瘤转移风险，从而进行预防性治疗。

3 外泌体与DP细胞诱导功能

3.1 外泌体与Wnt信号通路

毛囊形成和周期性生长涉及到多种信号通路，如转化生长因子-β(TGF-β)、Shh、Wnt等。有研究结果表明，Wnt信号能够促进毛囊干细胞增殖，加速毛囊从休止期向生长期过渡[16]。事实上，目前已经明确Wnt/β-catenin在DP细胞诱导毛发再生的关键作用，其与DP细胞促进毛囊发育和周期性生长作用均密切相关[16]。在AGA脱发机制研究中，研究者利用双氢睾酮(DHT)干预DP细胞，观察到Wnt10b表达下调和Wnt通路抑制因子DKK1表达上调，激活糖原合成酶激酶-3β(GSK-3β)，磷酸化β-连环蛋白(β-catenin)，使Wnt通路失活，影响下游基因c-myc等的表达，导致DP细胞丢失毛囊诱导功能，并以旁分泌方式抑制毛囊干细胞分化[17]。鉴于Wnt信号通路与DP细胞诱导功能有紧密相关，研究者针对外泌体和Wnt信号通路进行了深入的探索。Gross等[18]阐述外泌体包含活性Wnt因子(Wnt5a和Wnt3a)，Stem Cells Dev杂志报告了CD63+外泌体通过运输Wnt信号通路配体蛋白及mRNA进行细胞间信息交流，促进骨髓间充质干细胞刺激皮肤修复和再生进程[19]。在肿瘤微环境中，外泌体介导Wnt信号分子的转移，调节Wnt信号通路活化，从而影响肿瘤细胞状态，而间充质干细胞通过衍生的富含Wnt4a外泌体，激活Wnt/β-catenin信号通路，促进皮肤组织的修复和再生[20]。另外，Zhou等[21]在毛囊不同周期应用DP细胞衍生的外泌体，发现其通过激活Wnt信号通路，促进外根鞘细胞增殖和迁移，进一步证实了外泌体通过Wnt信号通路影响毛囊再生的潜在作用环路。

3.2 DP细胞与其衍生的外泌体

毛囊底部的DP细胞可以通过释放多种因子，如Wnt信号通路相关因子、成纤维生长因子7(FGF7)和TGF-β等，以自分泌或旁分泌的作用方式促进毛囊上皮细胞增殖分化，调控间充质-上皮细胞相互作用，调节毛囊再生和周期[22]。DP细胞功能异常导致AGA发生，而外泌体与DP细胞诱导功能关键通路Wnt信号通路关联密切，DP细胞来源外泌体在毛发生长中的作用是毛囊生物学的研究热点。

低代细胞有毛囊诱导功能，随着传代，高代DP细胞(>6代)逐渐失去此功能。曹丹霞等[23]提取低代DP3细胞来源的外泌体培养高代DP8细胞，观察到后者细胞生物学特性改善，能够维持诱导毛发再生能力。在6周龄C57BL/6小鼠背部脱毛后，注射DP细胞衍生的外泌体(dermal papilla cell-derived exosomes，DPC-Exos)能够促进外根鞘(ORS)细胞增殖和迁移，同时上调β-catenin和Shh的表达，加速毛囊休止期至生长期过渡[21]。Kwack等[24]应用7周龄雌性C57BL/6小鼠，背部皮肤脱毛后每周注射DP-Exos，周期为26 d，实验结果与上述研究一致，进一步表明DPC-Exos在毛发生长过程中的重要作用。此外，有研究将间充质干细胞和DP细胞来源的外泌体毛发再生作用进行对比，发现DPC-Exos对TGF-β通路的激活，促进DP细胞增殖和毛发生长作用更明显[25]。这些结果均显示DP细胞可以分泌外泌体促进毛发生长，机制与Wnt等关键信号通路相关。

通常，获取DP细胞来源的外泌体可以通过二维和三维培养细胞方式。研究者通过对比两种培养方式，发现三维培养的DP球状体能够有效地诱导毛囊从休止期向生长期转换，而DP球状体衍生的外泌体miR-218-5p高水平表达，通过上调Wnt信号通路关键因子β-catenin的表达及下调Wnt信号通路抑制因子SFRP2，活化Wnt信号通路，加速毛囊从休止期进入生长期[26]。Chen等[27]发现三维培养DP球状体释放的DPC-Exos中miR-140-5p表达水平较高，可以抑制BMP信号通路，调控毛囊周期，由此推测球状体培养的DPC-Exos促进毛发生长的作用更明显。

3.3 间充质干细胞与其衍生的外泌体

间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSC)存在于骨髓、脐带血等器官间质中，可分化为多种间充质组织，如肌腱、脂肪骨髓基质、肌肉和软骨等[28]。研究人员在骨髓和脐带血中提取间充质干细胞，体外培养后形成自聚集的球状毛乳头样组织，随后注射裸鼠，6周后观察到毛发长出[29]。Bak等[30]使用0.1%地塞米松局部用药诱导毛发进入退化期，发现应用人脐带血来源的间充质干细胞能通过下调Wnt通路抑制因子DKK1缓解局部使用地塞米松诱导的毛发退化进程，显著促进DP细胞和角质形成细胞增殖，提示间充质细胞通过分泌某种因子的方式在皮肤附属器再生中的重要作用。在深Ⅱ度大鼠皮肤烧伤模型中，人脐带间充质干细胞衍生的外泌体“加速”Wnt/β-catenin信号促进1型和3型胶原的产生，加速伤口处皮肤的愈合，同时调节YAP信号的“刹车”抑制胶原蛋白的沉积，调控皮肤组织再生[20]。Rajendran等[31]用MSC衍生的细胞外囊泡处理DP细胞，发现DP细胞血管内皮生长因子(VEGF)和胰岛素样生长因子I(IGF-I)的mRNA表达水平上调，而MSC衍生的细胞外囊泡注射C57BL/6小鼠皮肤能够诱导小鼠背部毛发出现再生，显示MSC衍生出的细胞外囊泡具有激活DP细胞，促进DP细胞增殖，发挥促进毛囊从休止期向生长期进行转化的作用。上述结果显示，MSC衍生的外泌体类细胞外囊泡能够调控DP细胞的毛囊的诱导能力，促进毛发再生。

3.4 其他细胞衍生的外泌体

随着外泌体的研究深度和广度的增加，研究者发现外泌体的应用有益于解决条件介质中生长因子和细胞因子半衰期短的问题。如将脂肪来源的干细胞中分离出的外泌体加入DP细胞中，荧光显微镜下观察到外泌体能够进入DP细胞的胞质和核周，促进DP细胞的增殖和迁移能力，上调DP细胞诱导活性标志物碱性磷酸酶(ALP)的表达水平[32]。为了探究毛囊外根鞘细胞和血小板裂解液来源的外泌体能否维持DP细胞诱导毛囊的能力，研究人员进行外泌体的形态和DP细胞对外根鞘细胞和血小板裂解物外泌体摄取等系列实验，发现外根鞘细胞外泌体能够维持DP细胞传代后的毛囊诱导能力[33]。同样，人真皮成纤维细胞衍生的外泌体也能够促进DP细胞增殖，并激活DP细胞中Wnt/β-catenin配体的分泌，从而活化Wnt信号传导，影响毛发生长[34]。此外，从人角质形成细胞条件培养液中分离出外泌体加入到黑素细胞中进行培养，能够上调黑素细胞相关蛋白的表达，调节黑素细胞色素化能力，调控皮肤再生[35]。

4 结语

在脱发类疾病中，市面上暂且缺乏安全高效的治疗手段。药物非那雄胺和米诺地尔等能在一定程度上改善脱发症状，但需要长期服用，存在明显的不良反应。除了药物治疗，毛囊移植手术在临床上也较为常用，通过将患者健康毛囊单位移植至秃发区，改善患者脱发外观和自信心，但费用较高且自体毛囊供体短缺。在这种背景下，具有毛囊诱导功能的DP细胞成为脱发类疾病细胞疗法的“明星”种子选手，但体外培养的DP细胞容易发生衰老失去诱导功能，成为限制其临床应用的主要障碍。因而，靶向维持DP细胞诱导功能各种因子的研究成为毛发领域的研究焦点。外泌体能够促进细胞增殖、迁移和血管生成，加速组织修复和再生，且安全性较高，适合开发个性化药物，所以引起了研究者的关注。研究结果表明，包括DP细胞、不同来源的间充质干细胞、来源于脂肪干细胞和外根鞘细胞等在内的多种细胞通过外泌体的形式调控DP细胞的毛囊诱导能力，促进毛发再生，机制与Wnt等关键信号通路活化相关。随着对外泌体在毛发再生领域的研究，尤其是对DP细胞的增殖和诱导功能作用研究日益深入，发现其有利于延缓和干预DP细胞衰老，维持诱导功能，从而为雄激素性脱发的研究和治疗提供新的思路。目前，虽然外泌体在毛发再生方面的研究已取得了一些进展，但如何优化、分离、提纯和应用外泌体以及外泌体在毛发再生相关研究的具体分子机制还需进一步研究和探索。