微RNAs在脊髓缺血再灌注损伤中的研究进展

刘智明，宗 缘，章 鼎，尹 飞

吉林大学中日联谊医院脊柱外科，长春 130033

脊髓缺血再灌注损伤（SCII）是胸、腹主动脉术后最严重的并发症之一，可导致严重的神经功能障碍，甚至瘫痪［1］。SCII主要包括缺血和再灌注2个阶段，缺血发生在体内大动脉阻断或循环停止期间，再灌注包括活性氧和炎性细胞因子的释放以及细胞凋亡［2］。SCII的具体发生机制目前尚不清楚，近年来，对SCII的病因和发生机制的研究主要包括氧自由基介导的脂质过氧化损伤、炎性反应［3-5］、细胞内Ca2+超载［6-7］、以谷氨酸盐为主的兴奋性氨基酸的毒性作用［8］、细胞凋亡［9-10］和细胞自噬［11-12］等。微RNA（miRNA）是一类长度为19 ~ 25个核苷酸的非编码单链RNA，可以通过和其靶mRNA的3’非编码区（3’-UTR）上的互补核苷酸配对来抑制mRNA或蛋白质的合成，调控靶基因的表达，从而进一步调节细胞的生长、增殖、分化和凋亡［13］。靶基因的抑制或降解主要取决于miRNA与其靶基因的互补程度，如miRNA与目标mRNA部分配对，会抑制蛋白质合成；如miRNA与其靶mRNA完美（或接近完美）配对，则会导致mRNA降解。单个miRNA可以靶向数百个mRNA，并影响许多基因的表达。据统计，miRNAs能够调节人类基因组中多达30%的编码基因［14］。此外，miRNAs的作用机制涉及多种重要过程，包括凋亡、分化、发育、增殖和信号转导等。miRNAs已被证实与许多疾病的发生有关，包括自身免疫性疾病（如哮喘、嗜酸性食管炎、过敏性鼻炎和湿疹）［15］、癌症［16］、糖尿病及心血管疾病［17-18］、骨骼肌肉疾病［19］。miRNAs因在细胞液中的稳定性、在人类和哺乳动物之间的保守性和组织特异性成为重要的生物标志物，在调节神经系统疾病（包括SCII）中发挥着至关重要的作用［20-21］。

有研究发现，多种miRNA参与了SCII的发生，并通过不同的作用机制对SCII产生不同的影响。其中有些miRNA在SCII发生后表达上调，促进SCII的发生和发展，被称作负性调控miRNA，包括miR-372，miR-124、miR-204、miR-30c和miR-448［22-26］；有些miRNA在SCII发生后表达下调，抑制SCII的发生和发展，被称作正性调控miRNA，包括miR-22-3p、miR-199a-5p、miR-129-5p、miR-27a、miR-186-5p、miR-221和miR-497［27-33］。本文查阅了近年国内外miRNA对SCII影响的相关研究，分析不同miRNA对SCII的正向和负向调控作用，为治疗SCII提供新思路。

1 负性调控miRNAs

1.1 miR-372

Li等［22］建立大鼠SCII模型，取脊髓组织观察发现，SCII模型组大鼠脊髓组织miR-372水平明显升高，Beclin-1蛋白水平降低；采用miR-372抑制剂转染SCII细胞后发现，促凋亡调节因子Bax的蛋白水平降低。采用双荧光素酶报告实验研究miR-372与Beclin-1的关系，结果表明，miR-372抑制了损伤细胞Beclin-1的荧光素酶活性，miR-372抑制剂则增强了Beclin-1的荧光素酶活性，即miR-372负调控Beclin-1表达。为了进一步证实了miR-372抑制剂对动物模型的保护作用，在大鼠SCII模型脊髓损伤区注射miR-372抑制剂，结果显示，与对照组相比，注射miR-372抑制剂能更好地促进SCII大鼠的运动功能恢复。综上，miR-372抑制剂可通过上调Beclin-1减少神经细胞凋亡。

1.2 miR-124

Liu等［23］的研究发现，与假手术组相比，SCII组脊髓组织中miR-124的表达略有提高，转染miR-124反义寡核苷酸（antagomiR-124）后miRNA-124和p53的表达显著降低，而细胞有丝分裂标志物Beclin-1和LC3-Ⅱ的表达增高。具体表现为，与对照组比较，anagomiR-124转染组SCII发生6、12、24和48 h后的运动缺陷指数（MDI）明显降低，大鼠腰段脊髓运动神经元增加，凋亡细胞减少。综上，抑制miRNA-124对SCII的抑制作用，可能是通过诱导细胞有丝分裂和抗细胞凋亡作用实现的。

1.3 miR-204

Yan等［24］的研究发现，SCII发生6、12和24 h后，miR-204的表达明显增强，而LC3-Ⅱ与LC3-Ⅰ比值和Bcl-2表达明显下调。与对照组相比，鞘内注射antagomiR-204可显著抑制缺血后脊髓miR-204和caspase-3的表达，显著上调Beclin-1、Bcl-2的表达以及LC3-Ⅱ与LC3-Ⅰ比值。此外，鞘内注射antagomiR-204显著降低SCII发生6、12、24和48 h后的MDI，增加神经元数量，减少神经元凋亡。综上，抑制miR-204对SCII的抑制作用，可能是通过促进细胞自噬和抗细胞凋亡作用实现的。

1.4 miR-30c

Wang等［25］通过大鼠SCII模型和P12细胞氧糖剥夺（OGD）模型研究发现，与假手术组相比，SCII后miR-30c的表达上调，SIRT1的表达下调，具体表现为Basso-Beattie-Bresnahan（BBB）评分降低，P12细胞凋亡增加，白细胞介素-6（IL-6）和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）表达增加。miR-30c基因敲除组与假手术组相比，大鼠血清和脊髓组织中IL-6和TNF-α蛋白和mRNA水平大幅降低。与对照组相比，转染miR-30c的PC12 OGD细胞模型中SIRT1的荧光素酶活性显著下降；在转染了抗miR-30c的 PC12 OGD模型中 IL-6表达水平降低，说明下调miR-30c基因表达可以通过SIRT1途径来抑制大鼠SCII，还可减少OGD处理后PC12细胞的凋亡和炎性反应。综上，miR-30c可能是SCII的致病因素之一，也是判断SCII预后的生物标志物和潜在的治疗靶点。

1.5 miR-448

Wang等［26］的研究发现，miR-448在SCII组织中表达显著增加，SIRT1表达显著降低。流式细胞仪检测结果发现缺氧可明显促进细胞凋亡，PC12细胞经过缺氧处理后miR-448表达上调，SIRT1表达明显下调。而miR-448抑制剂通过上调SIRT1逆转缺氧诱导的细胞凋亡，改善神经功能，缓解SCII。

2 正性调控miRNAs

2.1 miR-22-3p

Fang等［27］的研究发现，SCII发生12 h后，miR-22-3p表达明显下调，干扰素调节因子5（IRF5）表达上调。双荧光素酶报告基因检测表明IRF5是miR-22-3p的靶基因，可以被miR-22-3p负调控。过表达miR-22-3p或沉默IRF5可减轻脊髓组织的炎性反应，提高Tarlov评分，减轻SCII的程度。有研究［28］发现，巨噬细胞是SCII重要的效应细胞，SCII脊髓组织来源的巨噬细胞中IRF5的表达显著提高，上调miR-22-3p表达可促进巨噬细胞极化，并通过抑制IRF5抑制组织炎性反应，从而减轻脊髓SCII。综上，上调miR-22-3p表达可抑制巨噬细胞内IRF5的表达，从而抑制SCII的发展，为治疗SCII提供了新的靶点。

2.2 miR-199a-5p

Bao等［29］的研究发现，与假手术组比较，SCII组脊髓组织中miR199a-5p的表达显著下调。将miR-199a-5p模拟物、miR-199a-5p抑制剂和生理盐水分别注入SCII组大鼠髓鞘内5 d后检测miR-199a-5p的表达水平，结果显示，SCII组大鼠BBB评分较假手术组明显降低，miR-199a-5p模拟物组较生理盐水组显著升高，miR-199a-5p抑制剂组较生理盐水组显著降低。此外，在SCII发生24 h后，与假手术组比较，生理盐水组和miR-199a-5p抑制剂组神经元数量明显减少、细胞凋亡率明显增高；miR-199a-5p模拟物组神经元数量显著增加，细胞凋亡率明显降低，证明miR-199a-5p对大鼠SCII有抑制作用。

2.3 miR-129-5p

Li等［30］的研究发现，与假手术组相比，SCII发生12、48 h后，miR-129-5p表达均明显下调，高迁移率族蛋白-1（HMGB1）水平从SCII发生12 h后开始显著升高。荧光素酶报告实验发现miR-129-5p负向调节HMGB1。SCII发生后，损伤细胞立即释放HMGB1，并通过趋化因子和细胞因子募集大量的炎性细胞因子，损伤脊髓组织。此外，HMGB1在损伤脊髓中的表达随着时间的推移而增加。与假手术组相比，鞘内注射miR-129-5p模拟物可显著抑制HMGB1和TLR3的表达。综上所述，miR-129-5p通过抑制HMGB1来减轻SCII后神经炎性反应。

2.4 miR-27a

Li等［31］通过溴化乙锭（EB）染色渗出法观察血-脊髓屏障（BSCB）的通透性。结果显示，与假手术组相比，SCII发生24、72 h时，SCII组EB渗出明显增加；鞘内注射miR-27a模拟物可减轻BSCB功能障碍，表现为SCII发生24、72 h时EB渗出和荧光染料含量减少；鞘内注射抗miR-27a寡核苷酸（AMO-27a）却加重了BSCB的EB渗漏。与SCII组和阴性对照组相比，鞘内注射miR-27a可减轻SCII诱导的TLR4激活和炎性损伤，表现为SCII发生24、72 h时EB渗出减少，核因子-κB（NF-κB）和IL-1β水平降低。综上，miR-27a通过抑制TLR4信号通路和NF-κB/IL-1β通路来减轻SCII诱导的脊髓组织炎性损伤，为SCII的治疗提供了新的治疗靶点。

2.5 miR-186-5p

Chen等［32］的研究发现，SCII发生后miR-186-5p水平显著降低。鞘内注射miR-186-5p模拟物、AMO-186-5P或生理盐水24 h后，miR-186-5p模拟物组miR-186-5p表达显著增加，AMO-186-5p组则相反。与生理盐水组比较，miR-186-5p模拟物组大鼠神经元明显增多，而AMO-186-5p组大鼠神经元坏死或死亡明显增多。术前用miR-186-5p预处理可改善神经功能和组织学评分，减轻脊髓水肿，降低IL-15、IL-6、IL-1β和TNF-α的表达。综上，miR-186-5p可通过减轻脊髓水肿来抑制SCII。

2.6 miR-221

Zhao等［33］采集20例SCII患者的血样，并以20名健康人群的血样作为对照。AGE1.HN和SY-SH-5Y神经细胞系在OGD条件下进行实验。结果显示，SCII患者miR-221的表达水平低于健康对照组，TNFAIP2的表达水平高于健康对照组。在AGE1.HN和SY-SH-5Y神经细胞SCII模型中，miR-221表达明显下调，TNFAIP2和炎性细胞因子TNF-α和IL-6水平均升高，细胞凋亡百分比增加。以上结果证明，TNFAIP2是miR-221的靶基因，受miR-221的负调控，miR-221过表达可抑制炎性反应和细胞凋亡，敲除miR-221基因后炎性反应和细胞凋亡增加。综上，miR-221过表达可逆转TNFAIP2诱导的炎性反应和细胞凋亡。

2.7 miR-497

Xu等［34］的研究发现，与SCII组相比，miR-497模拟物预处理组上调了miR-497表达，IL-1受体相关激酶（IRAK1）和环磷酸腺苷反应元件结合蛋白（CREB）的表达显著降低。miR-497转染后，作为miR-497潜在靶点的Toll样受体4（TLR4）、NF-κB和Caspase-3被显著抑制，从而阻止了炎性细胞因子和凋亡调节因子的产生。ERK、Bax、Bcl-2和Bcl-xl等促凋亡相关基因的表达均随着IRAK1和CREB的下调而降低。综上，miR-497通过抑制IRAK1和CREB信号通路减轻脊髓的炎性反应和细胞凋亡来抑制SCII。

3 结语与展望

目前对SCII的治疗包括药物治疗，如激素冲击联合神经营养药物、他汀类药物、米诺环素和中药，还包括缺血预处理、低温预处理和高压氧疗法等。miRNA作为非编码单链RNA，可负性调控靶基因的表达，在抑制SCII方面发挥了至关重要的作用。在SCII发生后，正性调控miRNAs表达量下降，若高表达此类正性调控miRNAs，其对应的靶基因表达量将下降，从而抑制SCII；负性调控miRNA在SCII发生后表达量升高，对应的靶基因表达量下降，而这些靶基因的翻译产物却对SCII有抑制作用，而抑制负性调控miRNAs表达，使靶基因表达量升高，可抑制SCII。总之，2种不同类型的miRNAs主要是通过减少细胞凋亡和自噬、抑制炎性反应和减轻脊髓水肿发挥抑制SCII的作用，为临床治疗SCII提供了新思路。

虽然近年来已经进行了相当多涉及miRNA疗法的临床研究，但到目前为止只有一小部分miRNA进入临床开发阶段。miRNA疗法的挑战：①确定不同疾病的最佳miRNA靶点。②设计miRNA递送载体。③使候选治疗药物具有更高的稳定性，实现组织特异性靶向。④避免潜在的毒性和靶外效应。⑤miRNA治疗的特异性差，可能会损伤其他不需要治疗的正常组织和器官，达不到预期的治疗效果。例如为了克服癌症中miRNA表达异质性带来的障碍，需要在疾病进展过程中对各种组织在不同时间进行多次活检，以确定该miRNA调控的mRNA，然后对其进行治疗操作。为了解决这些难题，近年来，科学家们正在积极探索其可能的解决方案，包括结合并参考TargetScan等预测网站预测miRNA的靶点，识别与疾病相关的miRNA和mRNA。此外，在疾病特异性过程中寻找关键调控miRNA的另一个策略是使用miRNA模拟物或抑制剂进行全基因组功能筛选。目前，基因组和蛋白质组数据的激增有助于识别药物开发的关键miRNA靶点，应该能够使miRNA疗法成为现实。