酶解罗汉果提取物在口含烟加香中的应用

吴 彦，徐赫男，薛 云，刘启斌，刘 鸿，李志华，陆 漓，许春平

（1.广西中烟工业有限责任公司技术中心，南宁 530001；2.康赞（北京）生物科技有限公司，北京 100176；3.郑州轻工业大学食品与生物工程学院，郑州 450002）

近年来，随着世界控烟形势的日趋严峻，世界各国烟草行业已把研究和开发包括口含型烟草在内的新型烟草制品作为解决烟草行业未来发展瓶颈的重要手段和战略取向［1，2］。由于口含型烟草制品不经过燃烧环节，由口腔直接吸收，相对于传统卷烟，消除了二手烟的危害，世界卫生组织认为其安全性更高，是传统卷烟的理想替代品［3，4］。口含型烟草制品的研发和销售在北欧和北美等一些国家和地区取得了较快发展，市场销量不断增加。然而，美国、瑞典等国家的口含烟制品在口味上并不能广泛迎合中式卷烟消费群体，中国亟需培育具有中国特色的新型烟草制品以应对国际烟草巨头的挑战。

中医中药是中华民族的瑰宝。中医学自古以来就有“药食同源”理论。根据中药的功能性配伍，在口含烟中添加从药食同源的植物中提取的天然成分，不仅具有调节口味的传统功效，而且其含有的活性成分还是对吸烟者健康的有益补充。

罗汉果，葫芦科多年生藤本植物的果实，被誉为“神仙果”，是国家首批批准的药食两用材料之一。罗汉果含丰富的维生素以及糖甙、果糖、葡萄糖、蛋白质、脂类等成分，具有润肺止咳、生津止渴的功效。因此，将罗汉果提取物添加到口含烟中发挥其清咽利喉、生津止咳的功效，既能使消费者享受吸烟带来的满足感，同时又能减轻烟草中的有害物质对人体造成的伤害。然而，传统方法提取的天然香料粗提物中不可避免地带有蛋白质、淀粉、蜡质等大分子物质［5，6］，这些物质会严重影响口含烟的吸食体验。据文献报道［7-14］，复合生物酶可以降解植物细胞间质中的大分子成分，使之转化为单糖、氨基酸和致香物质前体，同时还能破坏植物细胞壁的致密结构，从而改善提取物的口感，提高有效成分的提取得率。

本研究将生物酶解技术应用于功能型口含烟天然香料的提取工艺中，用气相色谱-质谱联用技术分析化学成分，利用峰面积归一化法计算各个峰的相对含量，对比了普通水提法和酶解法得到的罗汉果香料的挥发性化学成分。酶解法不仅能够优化提取物的风味品质，还可以提高致香成分的含量，为研究和开发具有中国特色的新型烟草制品供了有力的技术支撑。

1 材料与方法

1.1 试验材料

罗汉果，购自广西壮族自治区桂林市；口含烟基料，上海新型烟草研究院提供；α-淀粉酶、纤维素酶、漆酶、果胶酶、风味蛋白酶由康赞（北京）生物科技有限公司提供；无水乙醇、碳酸氢钠、丙二醇、山梨酸钾、木糖醇，国药集团化学试剂有限公司，均为分析纯。

1.2 仪器与设备

EYELA N-1300DW型旋转蒸发仪、EYELA NVP-2000型隔膜真空泵、EYELA CA-116A型 冷却水循环装置，上海艾朗科技有限公司；HWCL-5型集热式恒温磁力搅拌浴，郑州长城科工贸有限公司；GZ120 GZ120.S型悬臂式恒速强力电动搅拌机，江阴市保利科研器械有限公司；303-4B型电热恒温恒湿培养箱，余姚市仪器仪表厂；Q-100A3型高速多功能粉碎机，上海冰都电器有限公司；TG-16G型台式高速离心机，常州市金坛高科仪器厂；Agilent 6890/5973型气质联用仪，美国Agilent公司；MS204S型分析天平，Mettler Toled。

1.3 试验方法

1.3.1 常规醇提法制备罗汉果口含烟用香料 将罗汉果粉碎至40目，精确称取100.00 g罗汉果粉末，置于1 000 mL的圆底烧瓶中，每次加入75%的乙醇600 mL，回流提取2次，每次2 h，将2次浸提液合并，于50℃下减压浓缩，得到相对密度为1.33的罗汉果浸膏38.75 g。将上述罗汉果浸膏加入100 mL无水乙醇充分回溶，将其回溶液在10 000 r/min的转速下离心10 min，取上清液，用0.20 μm有机微孔滤膜过滤，得到红棕色罗汉果口含烟用香料，冷冻待分析。

1.3.2 酶解法制备罗汉果口含烟用香料 将罗汉果粉碎至40目，精确称取100.00 g罗汉果粉末，置于1 000 mL的圆底烧瓶中。加入50 mL混合酶制剂（其中溶有α-淀粉酶0.2 mol/L、纤维素酶0.3 mol/L、果胶酶0.15 mol/L、风味蛋白酶0.3 mol/L），于55℃下酶解反应2 h。酶解后，将混合物在115℃下高温处理，使酶制剂中的酶失活。将经酶制剂处理过的罗汉果用600 mL 75%的乙醇水溶液于80℃下回流提取2次，每次2 h。将2次浸提液合并，减压浓缩除去溶剂，制得相对密度为1.32的罗汉果浸膏50.80 g。将上述罗汉果浸膏加入100 mL无水乙醇充分回溶，将其回溶液在10 000 r/min的转速下离心10 min，取上清液，用0.20 μm有机微孔滤膜过滤，得到棕褐色罗汉果口含烟用香料，冷冻待分析。

1.3.3 罗汉果烟用香料的GC-MS分析

1）样品的预处理。准确称取20.00 g制备好的样品于1 L圆底烧瓶中，加入300 mL去离子水和适量沸石，同时蒸馏萃取装置的另一端为装有40 mL二氯甲烷的250 mL圆底烧瓶，在水浴温度60℃下萃取2 h。萃取完毕后，向萃取液中加入0.2 mL内标溶液（称取0.50 g硝基苯置于100 mL容量瓶中，甲醇定容至刻度），减压浓缩至2 mL，用无水硫酸钠干燥，然后进行GC/MS分析。每个样品平行测定5次。

2）GC/MS分析。GC/MS分析条件：HP-5MS毛细管柱（60 m×0.32 mm×0.25 μm）；进样口温度：250℃；程序升温：初始温度50℃，维持3 min，以5℃/min升温 至260℃，维 持5 min；汽 化 温度：270℃；载气：He，1 mL/min；分流比：5∶1；电离方式：电子轰击（EI）；检测器温度：300℃；传输线温度：280℃；电离能量：70 eV；离子源温度：230℃；质量扫描范围：30～700 amu；检索谱库：NIST11谱库。

1.3.4 罗汉果风味袋装口含烟的制备 取4份50 g口含烟基料，分别加入5、10、15、20 g口含烟用罗汉果提取物，5 g甜味剂（50%的蜂蜜和50%的木糖醇），在温度为80℃的条件下，于恒温恒湿箱中湿热处理2 h。将湿热处理后的烟草物料水分含量调节到40%。在水分调节后的物料中加入2.0 g碳酸氢钠作为酸碱调节剂并混合均匀。在酸碱调节后的混合物料中喷洒加入3 g食用薄荷精油。在加香后的物料中添加2 g维生素E、0.15 g山梨酸钾和2 g丙二醇，密封平衡后用热封过滤纸包装成小袋，紫外杀菌处理后即得罗汉果风味的袋装口含烟制品。

2 结果与分析

2.1 样品特征描述

通过普通醇提法和酶解法制备的罗汉果口含烟用香料的外观、收率及香型特征如表1所示。由表1可知，酶解法提取的罗汉果口含烟用香料收率为50.80%，明显高于普通醇提法的收率38.75%，原因是复合酶可以破坏细胞间质的致密成分，从而减少细胞渗透阻力，促使有效成分充分溶出。2种提取方法得到的罗汉果浸膏都具有罗汉果的特征香味，酶解提取法得到的罗汉果浸膏颜色加深，香气更加醇厚，层次感更加丰富，原因是生物酶可以降解罗汉果中的淀粉、蛋白质、鞣酸等对口味不利的大分子物质，使之转化为氨基酸、单糖等小分子物质和致香物质前体，从而改善和丰富提取物的口感。

表1 不同提取方法制备的罗汉果香料的外观及香型特征

2.2 GC/MS分析鉴定结果

对罗汉果提取物选用HP-5MS毛细管柱，进样0.5 μL，利用气相色谱-质谱联用仪进行分析鉴定，采用峰面积归一法，定量出各化学成分的相对质量分数。按照上述GC-MS分析条件对罗汉果挥发性化学成分进行分析，通过谱库检索（谱库：NIST11谱库），醇提法和酶解法分别鉴定出挥发性半挥发性成分22种和30种，分析结果如表2和表3所示。

表3 罗汉果提取物挥发性香味化学成分的GC-MS分析结果（酶解法）

从表2可以看出，醇提法提取的罗汉果浸膏中，共分离并鉴定出了22种化合物，所鉴定的组分占总峰面积的92.60%。主要成分有角鲨烯（14.32%）、顺式十八碳-9-烯酸（12.58%）、香叶基芳樟醇（12.48%）、棕榈酸（10.26%）、香叶基香叶醇（9.27%）、硬脂酸（8.47%）、2-亚甲基-5α-胆甾烷-3β-醇（7.36%）、5-羟甲基糠醛（4.28%）等。

表2 罗汉果提取物挥发性香味化学成分的GC-MS分析结果（醇提法）

从表3可以看出，酶解法提取的罗汉果浸膏中，共分离并鉴定出了30种化合物，所鉴定的组分占总峰面积的95.83%。主要成分有糠醛（12.46%）、香叶基香叶醇（13.34%）、棕榈酸（12.43%）、香叶基芳樟醇（9.26%）、硬 脂 酸（6.25%）、5-羟 甲 基 糠 醛（6.21%）、2-亚甲基-5α-胆甾烷-3β-醇（5.78%）、2-乙酰基吡咯（4.27%）等。

比较分析表2和表3，醇提法和酶解法提取的罗汉果香料中致香物质的成分和含量存在一些差异，采用醇提法制备的罗汉果浸膏中，含量较高的致香成分主要有酸类、烯烃类、醇类和醛类等。酶解法制备的罗汉果浸膏中，主要致香成分除了醛类、醇类和酸类外，还包括酯类和杂环类等化合物。酶解法提取的罗汉果香料中含有5-羟甲基糠醛、角鲨烯、金合欢醇、2，3-二氢-3，5-二羟基-6-甲基-4（H）-吡喃-4-酮、香叶基香叶醇、香叶基芳樟醇、顺-β-金合欢烯等丰富的香味成分物质，其中，5-羟甲基糠醛具有似焦糖、谷物烘烤气息，有果香、面包香；角鲨烯是烟叶中非色素的萜烯类物质，既能增进烟叶的香气和吸味，又可通过降解转化形成致香成分；金合欢醇［15］具有特有的铃兰花香气，并有青香和木香香韵；顺-β-金合欢烯、2，3-二氢-3，5-二羟基-6-甲基-4（H）-吡喃-4-酮等也是烟叶中的重要致香成分。

酶解法提取的罗汉果浸膏致香成分的种类更加丰富，原因是复合酶制剂可以使对口味不利的蛋白质、淀粉、鞣酸、蜡质等大分子物质分解和转化为致香物质前体，从而促进致香物质的积累和生成。

2.3 罗汉果提取物添加到口含烟的感官评价结果

将酶解法制备的罗汉果提取物添加到口含烟基料中，按“1.3.4”方法制成袋装口含烟制品。组织专业人员进行感官评价，结果表明，该香料添加量为口含烟基料的质量百分比30%时口感最佳，罗汉果的香味醇厚，口味甘甜，润肺止渴生津，且与烟草本身所特有的味道完美融合，口感纯正。

3 小结

酶解法提取的罗汉果香料致香成分含量丰富，适用于口含烟加香。将该香料按照质量比30%添加到袋装口含烟中，罗汉果的香味醇厚，口味甘甜，润肺止渴生津，且与烟草本身所特有的味道完美融合。该罗汉果提取物丰富了袋装口含烟制品的风格特征，改善了袋装口含烟口感协调舒适性，既满足了吸食者的心理需求，又保护了吸食者的身体健康，赋予产品多元化功能。