乳酸菌发酵对脱溶菌酶蛋清凝胶性质与风味物质的影响

陈杰，常翠华，李俊华，苏宇杰，顾璐萍，杨严俊*

1(食品科学与技术国家重点实验室(江南大学)，江苏 无锡，214122)2(国家功能食品工程技术研究中心(江南大学)，江苏 无锡，214122)3(江南大学 食品学院，江苏 无锡，214122)

蛋清(egg white, EW)营养价值丰富，富含多种人体必需氨基酸，蛋清中蛋白质占比约11%(质量分数)，主要蛋白成分有卵白蛋白(ovalbumin, OVA, 54%)、卵转铁蛋白(ovotransferrin, OVT, 12%～13%)、卵类黏蛋白(ovomucoid, OVM, 11%)和溶菌酶(lysozyme, LYS, 3.4%～3.5%)(质量分数)[1-2]。LYS是一种碱性球蛋白，其等电点pI=10.7，可以通过催化N-乙酰胞壁酸和N-乙酰葡糖胺之间的β-1,4-糖甘键水解，进而破坏革兰氏阳性菌细胞壁肽聚糖结构[3]。工业化分离提取溶菌酶已经在国内蛋品企业实现，然而针对脱溶菌酶蛋清(lysozyme-free egg white, LFEW)的高附加值应用却鲜有研究。

鸡蛋干是以全蛋液或蛋白液为原料，利用蛋白质的热凝固性，经过加热成型的一种新型蛋制品，其外观与豆腐干类似，口感细腻，发展前景广阔[4-5]。在高温灭菌过程中，蛋清中的葡萄糖会与蛋白质发生美拉德反应导致鸡蛋干的褐变并且蛋腥味较重。为了掩盖腥味并丰富口味，传统鸡蛋干多经卤制而成深褐色，但这破坏了鸡蛋蛋白原有的洁白外观和特有的蛋香味。如何实现对LFEW脱糖脱腥成为本研究的重点。有研究表明，酵母发酵蛋液脱腥的效果较好[6-7]，但实际上酵母发酵后会产生更加不受欢迎的酵母味，完全丧失了鸡蛋原有的香气，而针对乳酸菌发酵对蛋清脱腥的研究却是少有。考虑到脱去溶菌酶可以减少对乳酸菌的生长抑制，本研究利用乳酸菌发酵实现LFEW的脱糖和脱腥，并拟开发一款具有良好保水性和质构特性、洁白Q弹、又具有独特蛋香风味的蛋白干产品。这项研究也可为工业化LFEW的开发利用提供一种新方向，拓宽了蛋制品深加工产业链。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

原料：新鲜鸡蛋，当地超市采购。

试剂：Xanterra离子交换树脂，Xanterra科技有限公司；A051-1-1溶菌酶测定试剂盒，南京建成赛浩科技有限公司；植物乳杆菌LP90、保加利亚乳杆菌LB42、嗜热链球菌ST81，微康益生菌(苏州)股份有限公司；安琪高活性干酵母，安琪酵母股份有限公司；过氧化物酶、葡萄糖氧化酶，Sigma-Aldrich公司；无水葡萄糖、硫酸铜、硫酸锌、氢氧化钠、亚铁氰化钾等，国药集团。

1.2 仪器与设备

Heracles Ⅱ快速气相色谱电子鼻，法国Alpha MOS S.A有限公司；SCIONSQ-456-GC气质联用仪，美国布鲁克公司；TA.XTPlus物性分析仪，英国SMS公司；UltraScan Pro1166高精度分光测色仪，美国Hunterlab公司；UH5300分光光度计，日本日立公司；DZ-260C真空包装机，安徽逸飞智能包装机械有限公司；ZQZY-78AN振荡培养箱，上海知楚仪器有限公司；GZX-9146MBE电热鼓风干燥箱，上海博讯实业有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 蛋白干样品的制备工艺

研究思路如图1所示[5,8]。

图1 工艺流程图Fig.1 Process flow diagram

1.3.1.1 脱溶菌酶蛋清的制备

取新鲜鸡蛋，分离出蛋清，采用T25D S25高速均质机在7 000 r/min下处理2 min，使用50 g/L食品级柠檬酸溶液调节pH至7.0，通过200目筛网除去泡沫与杂质，加入25%(质量分数)湿树脂，搅拌吸附90 min(pH 7.0，32 ℃，210 r/min)，再通过200目筛网除去树脂及其他杂质，收集LFEW备用，测得总固形物含量为12.98%(EW为14.08%)，蛋白质量浓度为113.5 mg/mL(EW为124.74 mg/mL)及溶菌酶脱除率为96.62%。

1.3.1.2 乳酸菌发酵脱溶菌酶蛋清

将脱去溶菌酶后的蛋清液分别添加0.1%(质量分数)安琪酵母(yeast, YE)，3×108、6×108、9×108CFU/mL的植物乳杆菌LP90(Lactiplantibacillusplantarum, LP)、嗜热链球菌ST81(Streptococcusthermophilus, ST)、保加利亚乳杆菌LB42(Lactobacillusbulgaricus, LB)，放入振荡培养箱发酵6 h(设置参数37 ℃，120 r/min)，得到LFEW发酵液LFEW-YE、LFEW-LP、LFEW-ST、LFEW-LB。分别于2、4、6 h取样测定pH，并参考GB/T 16285—2008《食品中葡萄糖的测定 酶-比色法和酶-电极法》测定样品中葡萄糖含量，计算脱糖率。以EW为对照。

1.3.1.3 蒸煮制胶、烘干

使用食品级柠檬酸和碳酸钠将发酵蛋清液调节pH至9.0(与EW保持一致)，各取30 mL装入50 mL平底离心管内，于90 ℃水浴锅内加热蒸煮20 min，蒸煮结束立刻使用冰水冷却降温，并放入4 ℃冰箱内冷藏过夜。次日取出，脱模，切块为10 mm高圆柱形，放入60 ℃烘箱内20 min烘干表面水分，用于测定凝胶质构。并以EW与LFEW作为对照。

1.3.1.4 真空包装、灭菌

将烘干后的蛋白干使用真空包装机进行抽真空包装，并使用高压灭菌锅灭菌处理。真空包装参数：抽真空20 s，封口时间1.5 s，冷却时间3.5 s。灭菌参数：121 ℃，15 min。灭菌后的蛋白凝胶用于测定色差。

1.3.2 凝胶质构测定

使用TA.XTPlus物性分析仪测定凝胶质构。凝胶样品是高度为10 mm，直径为25 mm的圆柱体，采用P/36R平底型探头。使用Texture Expert软件版本1.22由力-时间变形曲线计算硬度、弹性、胶黏性、咀嚼性和回复力。测定参数：质地剖面分析(texture profile analysis, TPA)模式，测试前速5 mm/s；测试速度1 mm/s；测试后速5 mm/s；压缩模式：样品形变量50%，触发点负载5 g[9]。每个样品做平行4组。

1.3.3 保水性(water holding capacity, WHC)测定

根据LI等[10]描述的方法测定样品的凝胶保水性，并稍加修改。将制成凝胶样品切块，称取10 g左右样品，擦干表面水分，于8 000 r/min离心20 min，倒出离心管内上清液水分，擦干样品再次称重，WHC的计算如公式(1)所示：

(1)

式中：WHC，样品保水性，%；m0，样品离心前质量，g；m1，样品离心后质量，g。

1.3.4 色差测定

将真空包装灭菌后的蛋白干样品用透明蒸煮袋分装，以透明蒸煮袋为空白对照，使用高精度分光测色仪测定样品的色度。记录L*(亮度)，a*(红/绿)和b*(黄/蓝)值。并计算凝胶的白度指数(whiteness index, WI)，WI的计算[11]如公式(2)所示：

(2)

1.3.5 腥味值感官评定

经脱腥处理后的蛋白干，由10名受过训练的感官评定员进行品评，分别给样品的腥味打分，计分原则：满分5分，以去蒸馏水作为参照(分值为0分)，分值越大，则表示腥味越重或异味更重。最后，取平均值作为每个样品的腥味值。感观评分标准如表1所示。

表1 蛋白干腥味值感官评分标准Table 1 The Sensory scoring standard of egg white gels smell value

1.3.6 快速气相色谱电子鼻

称取3.00 g蛋白干样品，加入2 mL去离子水捣碎，装入15 mL顶空瓶中，采用Heracles Ⅱ 型快速气相色谱电子鼻进行测定，每个样品做平行4组。参考陈正[12]的方法，稍作修改。仪器参数：进样量5 000 μL，采用色谱柱：DB-5、DB-1701，2个FID检测器温度均设为260 ℃。顶空萃取温度60 ℃；注射器温度200 ℃；捕获温度50 ℃。柱温50 ℃，先以1 ℃/s升至80 ℃，再以2 ℃/s升至250 ℃，保持60 s，数据采集时间177 s。采用快速气相电子鼻自带的AlphaSoft V14.2软件，将筛选出的区分能力强(>0.90)的色谱峰作为传感器进行主成分分析(principal component analysis, PCA)、识别因子分析(discriminate factorial analysis, DFA)。

1.3.7 气质联用(gas chromatograohy-mass spectrometry, GC-MS)条件

将蛋清凝胶与饱和盐水按照1∶1的质量比混合，使用高速剪切机10 000 r/min剪切2 min，准确称取4.5 g装入15 mL顶空气相瓶内。

GC条件[12-13]：使用TR-FFAP(30.0 m×0.25 mm×0.25 μm)色谱柱；进样口：柱箱温度50.0 ℃，进样口温度250 ℃；进样方式：不分流；流量控制模式：线速度；压力33.4 kPa，载气(He)，流速0.8 mL/min；升温程序：从40 ℃开始，以5 ℃/min升温至140 ℃，保持3 min，再以10 ℃/min升温至230 ℃，保持6 min。MS条件：电子轰击离子源(electron impact source, EI)，EI电子能量70 eV，发射电流1 mA，离子源温度210 ℃，传输线温度250 ℃，无溶剂延迟，质量扫描范围33～450m/z。

1.3.8 数据分析

实验数据采用平均值±标准差来表示，每组数据测定至少采用3个平行，所有数据使用Excel 2021进行数据处理，使用Origin 2018进行作图分析，使用IBM SPSS Statistics 19进行统计学分析。

2 结果与分析

2.1 不同乳酸菌对发酵脱糖率的影响

由图2-A可知，在相同乳酸菌添加量下，LFEW发酵效果比起未脱溶菌酶的EW脱糖率有显著提高，反应后pH值相较更低。这是由于蛋清溶菌酶作为一种糖苷水解酶，可以破坏肽聚糖中的N-乙酰胞壁酸和N-乙酰葡萄糖胺之间的β-1,4-糖苷键[3,14-15]，进而抑制作为革兰氏阳性菌的乳酸菌的生长繁殖，而通过树脂吸附脱去溶菌酶的蛋清液则可以不受溶菌酶的抑制作用，大大提高了发酵效率。图2-B通过对添加量，发酵时间的筛选，为保证脱糖率>90%，最终优化发酵条件为采用LFEW为原料，LP、ST、LB的添加量为6×108CFU/mL，37 ℃，发酵6 h，发酵的脱糖率均达到90%以上。

A-EW与LFEW；B-不同乳酸菌和不同发酵时间图2 不同发酵条件对蛋清脱糖率及pH的影响Fig.2 Effects of different fermentation conditions on glucose removal rate and pH of egg white

2.2 不同乳酸菌发酵对脱溶菌酶蛋清凝胶性质影响

2.2.1 凝胶质构与保水性分析

由表2可知，在pH 9.0，将经过树脂吸附与不同乳酸菌发酵的蛋清制成蛋白干，具有良好的弹性(>0.90)和保水性(>90%)，这是由于蛋清蛋白质多为酸性蛋白，在碱性条件下，蛋白质溶解性较好，且蛋白质之间静电斥力增加，蛋白质与水之间的相互作用增加。经过树脂吸附处理后的LFEW凝胶硬度有显著降低，而弹性与恢复力都有显著提高，分析其原因可能是树脂吸附处理降低了蛋清液的总蛋白浓度，也有研究说蛋清中LYS及LYS-OVA的凝胶硬度最高[1,16]，所以脱去蛋清中溶菌酶导致凝胶硬度的降低，但由于溶菌酶为蛋清中少有的碱性蛋白，会与蛋清中其他酸性蛋白结合，脱去溶菌酶减少了LYS-OVA与LYS-OVT聚合物的生成，提高了蛋清液的稳定性[17]，蛋白质与水之间的作用力增强，促进蛋清蛋白质与水之间形成致密的三维凝胶网状结构，进而提高了凝胶的弹性和恢复力。经过发酵处理后，凝胶的硬度、胶黏性、咀嚼性与恢复力都有显著降低，但弹性增加。这可能是因为在发酵过程中产生一系列蛋白水解酶可以水解蛋白质，导致蛋白质展开，疏水基团暴露，蛋白疏水性增加，导致蛋白凝胶性质降低[18-19]。也有研究证明发酵脱糖后的蛋清体系变得稀薄且亲水物质减少，显著降低了凝胶强度[20]。

表2 蛋白干质构数据表Table 2 Texture data of egg white gels

2.2.2 外观色差分析

凝胶产品的外观和颜色是一个重要的感官属性，可能会影响消费者的接受度[21]。观察高压蒸汽灭菌后蛋白干外观，由图3可知，经树脂吸附脱溶菌酶与发酵脱糖处理的蛋清凝胶外观更加洁白，这是因为乳酸菌发酵消耗了蛋清中的葡萄糖，避免了葡萄糖与蛋白质之间发生美拉德反应，进而解决了凝胶褐变问题。通过表3色差结果可知，经过发酵处理后制得的蛋白干的L*值显著提高，a*值与b*值显著降低，WI显著提高，表明发酵脱糖会使凝胶亮度增加、色泽变得更加洁白。不同发酵剂(YE、LP、ST、LB)比较，LP发酵后蛋白凝胶外观最为洁白。

表3 不同加工方式对蛋清凝胶色差影响Table 3 Effect of different processing methods on the color of egg white gels

2.3 不同乳酸菌发酵对脱溶菌酶蛋白干风味的影响

2.3.1 感官评定与电子鼻结果分析

由表4蛋白干腥味值感官评定结果可知，LFEW-YE制得蛋白干有严重酵母味，风味上最差；LFEW-ST蛋白干产生不受欢迎异味，树脂吸附(LFEW)对蛋白干风味无显著差异，LFEW-LB和LFEW-LP制得蛋白干感官最佳，其中LFEW-LB蛋白干具有类似玉米糊风味，只有LP发酵脱腥效果好又不产生其他突出气味。由PCA图(图4-A)可知，第一主成分和第二主成分的贡献率分别为97.499%和1.518%，累积贡献率为99.017%(远大于90%)，2个主成分可以用来代表样品的整体信息。判别指数主要用于评定不同组样品数据点间的区分程度，最大值为100，其值越大表明区分效果越好[22]。PCA图中判别指数达到63，样品整体气味轮廓均无重叠，表明经不同发酵条件处理后区分度较好，其中LP发酵后蛋白干相较EW距离最远，区分最为明显。DFA是一种用于构建模型并识别未知样品所属类别的方法，可以减少组间差异[23]。图4-B中DF1和DF2的贡献率分别为54.924%和38.483%，累计贡献率达到93.507%(>90%)，经过不同乳酸菌发酵处理后的蛋白干区分度十分显著，这说明乳酸菌发酵可以显著改变蛋白干风味物质。

2.3.2 GC-MS结果分析

为了进一步分析发酵对蛋白干风味物质的变化，通过GC-MS更加准确地分析了挥发性物质的含量变化。由图5中GC图谱可知，经过树脂吸附与发酵处理后的蛋白干挥发性物质发生明显的变化。通过MS鉴定出230多种挥发性风味化合物，选取相对面积占比>0.5%，相似度>800的物质汇总分析，结果保留65种主要挥发性物质(附表1，https://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1802.TS.20220419.1141.012.html)，其中以烃类、醇类、醛类、酮类、芳香族物质较多。原蛋清蛋白干检测出挥发性物质以四甲基苯、壬醛、萘、(+)-柠檬烯、月桂醇为主。四甲基苯具有腻甜与腐臭气味，萘具有柏油气味，它们可能是造成蛋白干腥味的主要物质；壬醛具有柑橘、玫瑰的清新香气，柠檬烯具有薄荷与三叶草香气，月桂醇具有肥皂、紫罗兰花香。经酵母菌发酵后主要挥发物质变为苯乙醇，相对含量占比高达67.85%，苯乙醇虽被报道具有玫瑰花气味[12]，但因为苯乙醇气味阈值较低，当含量较高时会导致酵母发酵后产生明显的刺鼻酵母味；经乳酸菌发酵后蛋白干的挥发性物质中醇类、酮类与醛类物质普遍增加，芳香族化合物显著减少。

表4 发酵蛋白干感官评价结果Table 4 Sensory evaluation of egg white gels

由表5的GC-MS结果可知，不同乳酸菌发酵所得蛋白干的挥发性物质也有较大差异。其中LP发酵蛋白干挥发性主物质变为苯甲醛、壬醛和辛烷醛(相对含量>5%)，ST发酵后蛋白干挥发性主物质为3-羟基-2-丁酮、α-氟-(对甲基)查尔酮、(-)-O-乙酰-L-苹果酸酐、(+)-柠檬烯和苯甲醛，LB发酵后蛋白干挥发性主物质为α-氟-(对甲基)查尔酮、苯甲醛、(+)-柠檬烯、2-庚酮和3-羟基-2-丁酮。乳酸菌发酵生成了更多的良好的挥发性物质，明显降低了四甲基苯与萘这类芳香族物质含量。结合感官评定与电子鼻结果，可知植物乳杆菌发酵脱腥效果最好，这可能是由于LP发酵后蛋白干的芳香族(四甲基苯、萘)显著减少，而醇类与醛类物质显著增加，其中芳香族物质总含量下降了24.37%，醇类物质总含量增加了10.29%，醛类物质增加了10.89%，明显增加的挥发性物质中，辛烷醛和苯甲醛分别具有柠檬与焦糖气味。这些醛类物质很可能是由蛋清蛋白的水解以及氨基酸的Strecker降解所产生[12]。

A-PCA图；B-DFA图图4 不同发酵条件蛋白干电子鼻主成分分析图Fig.4 Principal component analysis of electronic nose of egg white gels at different fermentation conditions

表5 蛋白干GC-MS检测结果(主要挥发性物质)Table 5 Results of GC-MS test of egg white gels (major volatile components)

A-EW;B-LFEW;C-YE;D-LP;E-ST;F-LB图5 不同发酵条件蛋白干GC-MS图Fig.5 GC-MS Finger pattern of egg white gels at different fermentation conditions

3 结论

本研究以脱溶菌酶蛋清为原料进行乳酸菌发酵脱糖，脱糖率可达90%以上。对比不同发酵剂发酵处理制备的蛋白凝胶的质构、外观和风味特征，发现经过树脂吸附与发酵处理会使凝胶硬度、胶黏性、咀嚼性显著下降，而凝胶的弹性与恢复力显著增加。LFEW经LP发酵(LP90添加量6×108CFU/mL，pH 7.0，37 ℃，120 r/min，6 h)后制得的蛋白干外观最为洁白，凝胶硬度、弹性、保水性都较佳，经感官评定和电子鼻分析，发现其脱腥效果也最佳。经过GC-MS鉴定，发现LP发酵后蛋白干的芳香族物质减少24.37%，而醇类与醛类物质分别增加10.29%和10.89%，其主要挥发性物质为苯甲醛、壬醛和辛烷醛(相对含量>5%)，它们可能为鸡蛋白提供了独特香气风味。综上，利用植物乳杆菌发酵处理的脱溶菌酶蛋清液，可用于开发一种低糖无腥、洁白Q弹的美味蛋白干产品。