核苷磷酸化酶的工程菌构建

段佩玲，王振宇，刘国生

(1.郑州铁路职业技术学院，河南 郑州 451460；2.河南师范大学生命科学学院，河南 新乡 453007)

核苷类物质是抗肿瘤、抗病毒类药物的重要来源。目前，核苷类化合物主要是通过发酵法、化学法、生物催化等方法进行合成。其中，发酵合成法难度较大，此方法既要考虑反馈调节机制，还需要考虑相关酶系的控制[1-2]；化学合成法过程中存在的问题较多，如反应环节多、反应条件不易控制等，而且须用到有机溶剂、重金属等有毒化合物，因此对实验人员及环境都易造成相当大的危害[3]；生物催化方法与上述两种方法比较具有较大优势，主要是因为其反应条件温和、合成效率高、对环境危害小。

阿糖鸟苷(ara-G)是一种能够降低T细胞白血病细胞活性[4-5]的重要核苷类药物，可以作为奈拉滨等药物的前药。阿糖鸟苷生物催化过程中主要涉及的酶包括核苷磷酸化酶和N-脱氧核糖转移酶[6]，但这些酶在野生微生物菌株含量一般都较低，而且多种酶往往同时存在，致使其生物催化反应过程受到限制，且存在产物多样性等诸多问题。基于上述原因，将来源不同的PNPase基因通过基因工程手段[7-8]进行重组构建工程菌，通过提高酶活来参与相应的核苷转化反应。相关研究认为，阿糖鸟苷生物催化合成使用“两步法”[9]：第一步为关键环节，是以阿糖尿苷(uracil arabinoside)和二氨基嘌呤为底物合成阿糖二氨基嘌呤核苷(diaminopurine arabinoside)；第二步主要是由PNPase(嘌呤核苷磷酸化酶)催化ara-U转化ara-DA。本研究利用基因重组技术将PNPase(嘌呤核苷磷酸化酶)基因deoD导入E.coli BL21(DE3)，以此构建工程菌株E.coli(deoD)，为生物转化阿糖鸟苷提供参考。

1 仪器与材料

1.1 仪器

PCR仪(Applied Biosystems)、高速冷冻离心机(Eppendorf)、凝胶成像分析系统(WD-9413B)。

1.2 试剂

DNA抽提试剂盒、克隆试剂(TaKaRa)、表达试剂(Salarbio)、细菌基因组质粒pMD18-T、质粒 p ET-28a(+)、E.coli BL21(DE3)感受态细胞与E.coli DH5α感受态细胞(宝生物工程有限公司)、二氨基嘌呤和阿糖尿苷(新乡拓新科技有限公司)，其他试剂均为分析纯。

2 方法与步骤

2.1 菌株活化和基因组提取

埃希氏菌E.coli AEM0812菌体经LB液体培养基37℃过夜培养后，选取合适浓度梯度涂布于LB固体培养基中，于36℃培养24小时，再次接种于LB液体培养基，36℃培养8～12小时。利用细菌基因组抽提试剂盒来抽提DNA。

2.2 引物设计和基因扩增

根据数据库Genbank中搜索的目的基因序列，通过引物设计软件与pMD18-T质粒图谱设计PCR扩增引物。5′端引物CCCATGGGATGGCTACCCCACACATTAAT，下划线部分为Nco I酶切位点。3′端引物CCTCGAGGTTACTCTTTATCGCCCAGCA，下划线部分为 Xho I的酶切位点。

deoD基因扩增条件：93℃预变性50～55秒，94℃变性30～35秒，50℃退火40秒，72℃延伸60秒；循环次数30。最后再延伸10分钟。采用琼脂糖凝胶电泳验证，如图1所示(M为DNA marker)。

图1 嘌呤核苷磷酸化酶基因PCR扩增结果

2.3 克隆载体pMD18-T-deoD的构建

将所得目的基因deoD进行纯化后，按照一定比例与pMD18-T质粒混合，17℃放35min进行连接反应以构建pMD18-T-deoD克隆载体。将克隆载体转化至感受态E.coli DH5α细胞，然后接种到通过含有对应抗生素的固体培养基36℃过夜培养，再经过LB液体培养基培养后利用试剂盒抽提质粒。Xho I和Nco I双酶切后进行电泳分析，在约730bp和2600bp处有两条条带，如图2所示(M为DNA marker，1为重组质粒p MD18-T-deoD)。对目的基因deoD进行DNA测序比对，结果与图1测序结果一致，证明重组质粒pMD18-T-deoD构建成功。

图2 双酶切重组质粒电泳

2.4 表达载体pET-28a-deoD的构建

将重组质粒 pMD18-T-deoD进行双酶切纯化后，将获得的包含黏性末端的目标基因与表达质粒pET-28a 混匀后加入连接体系进行PCR，进而将产物转到感受态细胞。通过含相应抗生素培养基培养筛选后，对阳性菌株进行质粒抽提并进行电泳分析。图3显示的两条带大约在5200bp和730bp处，经过测序，与前一次结果相同。以上证明成功构建表达载体，由此获得携带重组质粒pET-28a-deoD的工程菌菌株，并选取阳性菌落保存。

图3 双酶切pET-28a-deoD 后电泳

2.5 嘌呤核苷磷酸化酶(PNPase)的基因E.coli(deoD)诱导表达

菌体蛋白制备。LB液体培养基培养至菌液OD600值为0.55～0.80 ，加入IPTG继续培养6～8 小时后收集菌体，菌体超声破碎，离心处理得到沉淀。采用SDS-PAGE电泳[10]验证。

图4 deoD基因的SDS-PAGE表达图谱

如图4所示，M为预染彩虹蛋白 Marker，1～6分别表示埃希氏菌AEM0812、E.coli(pET-28a)、未经IPTG诱导的E.coli(deoD)、经IPTG诱导的E.coli(deoD)、E.coli(deoD)破碎后上清液、E.coli(deoD)破碎后沉淀。结果显示，E.coli(deoD)菌体经IPTG诱导，在26 KD出现了蛋白条带，与已知的嘌呤核苷磷酸化酶分子量25.85 KD大约相同，证明出现的此蛋白条带应为 PNPase表达产物，说明deoD基因成功表达。

3 结果与讨论

本研究将来源于埃希氏菌AEM0812菌株的嘌呤核苷磷酸化酶(deoD)基因通过PCR扩增后，连接到质粒pMD18-T上，利用原核表达体系pET-28a的强启动子T7将含有粘性末端的目的基因通过分子生物学技术构建重组载体，并将其导入大肠杆菌BL21(DE3)中，以此构建的工程菌菌株携带了重组质粒pET-28a-deoD。对上述构建的工程菌进行由IPTG诱导的蛋白表达，经过SDS-PAGE检测分析，蛋白表达量较原始菌株大幅提升，说明deoD基因成功表达，由此也证明成功构建了含有嘌呤核苷磷酸化酶的工程菌。通过构建E.coli(deoD)菌株，以获得催化阿糖鸟苷(ara-G)生物合成反应所用嘌呤核苷磷酸化酶的高产基因工程菌，不论是以工程菌全细胞进行发酵，还是以工程菌的粗酶液进行发酵，都可以大幅提高生产效率、降低成本，为工业化生产奠定基础。