基于复合酶制剂抑菌的糖蜜无酸发酵酒精技术的研究

尚红岩，杨凤婷，张洛铫，殷德运，郑子鑫，陈秀丽，郑毅锋，付金亿，黄泽彬，钟靖琪，曹嘉亮

(1广东轻工职业技术学院食品与生物技术学院，广东广州 510300；2广东省科学院南繁种业研究所，广东广州 510316)

0 前言

糖蜜是制糖副产物，富含蔗糖和还原糖，是发酵酒精最经济的原料之一[1]。但糖蜜原料中还含有灰分、胶体和杂菌等，会抑制酵母繁殖和发酵，容易造成发酵感染杂菌，使发酵酒精浓度降低，挥发酸升高，影响发酵产酒率，发酵前必须尽可能排除这些杂质[2]。传统糖蜜发酵酒精通过添加硫酸调节pH值来抑制杂菌，容易造成设备腐蚀、结垢和环境污染等问题[3]。以果胶酶、蛋白酶和溶菌酶等复合酶制剂用于糖蜜酒精发酵，一方面溶菌酶可以杀灭细菌，但对酵母没有杀灭作用，因此，可以替代硫酸实现无酸发酵。另一方面在蛋白酶、果胶酶等多种酶制剂协同作用下，将糖蜜中胶体、蛋白质等水解为酵母可以利用的糖和氨基酸等，有利于提高产酒率。另外，氨基酸等还可以增加酵母营养，提高酵母细胞密度，以酵母生长优势抑制杂菌，同时可以降低发酵液黏度，减少泡沫及避免蒸馏塔结垢，有利于节能减排[4-8]。

本文通过对糖蜜原料的无酸澄清后添加复合酶制剂到糖蜜中，进行酵母培养和连续发酵酒精，经过连续发酵，测定其中的还原糖、挥发酸、酒分含量。糖蜜酒精发酵中分别添加果胶酶、木瓜蛋白酶和溶菌酶进行单因素试验，研究3种酶的最适添加浓度；接着通过正交实验优化复合酶制剂添加量，研究最佳添加浓度组合。

1 材料与方法

1.1 原料及试剂

糖蜜，广西糖业集团有限公司；果胶酶100000 U/g，河南林博生物科技有限公司；溶菌酶2000 U/g、葡萄糖氧化酶30000 U/g，广州瑟烨生物科技有限公司；木瓜蛋白酶30000 U/g、纤维素酶30000 U/g，河南万邦实业有限公司；酿酒活性干酵母，广西丹宝利酵母有限公司；过磷酸钙、硫酸铵、碘液、酚酞等均为分析纯，广州化学试剂厂；浓硫酸，重庆长鹏化工有限公司；氢氧化钠，天津华东试剂厂。

1.2 主要仪器

UV-520紫外可见分光光度计，上海元析仪器有限公司；PHS-3精密酸度计，上海大普仪器有限公司；FA224电子分析天平，上海舜宇恒平科学仪器有限公司；DK-98-II电热恒温水浴锅，郑州长城科工贸有限公司；98-1-C数显控温电热套，天津市泰斯特仪器有限公司；YX-280型手提压力蒸汽灭菌锅，广州越特科学仪器有限公司；101-3AB型电热鼓风干燥箱，天津市泰斯特仪器有限公司；DHP-9162电热恒温培养箱，上海恒科科学仪器有限公司；酒精浓度计，河北省武强县同辉仪表厂；移液枪，济南欧莱博技术有限公司。

1.3 糖蜜发酵酒精工艺流程

糖蜜发酵酒精工艺流程如图1所示。

图1 糖蜜发酵酒精工艺流程

1.4 试验方法和步骤

1.4.1 糖蜜发酵培养基制备

糖蜜加水稀释到50°Bx，加过磷酸钙0.3%，硫酸铵 0.6%，加热不断搅拌至 80～85℃，自然沉降30 min，离心分离排除沉降物。再加水稀释到25°Bx，加入0.2%尿素，制成发酵培养基，降温到31℃备用。

1.4.2 酵母液制备

称取发酵培养基0.5%活性干酵母，加入20 mL 30℃无菌水活化10 min，制成酵母液。

1.4.3 糖蜜发酵酒精酶制剂添加浓度单因素实验

分别量取发酵培养基250 mL于锥形瓶中，接种活化好的酵母液，分别加入果胶酶(10、15、20、25 U/g)，木瓜蛋白酶(12、16、20、24 U/g)，溶菌酶(12、16、20、24 U/g)，进行单因素实验，分别置于生化培养箱中，31℃/140 r摇床培养48 h，发酵结束检测并记录发酵前后发酵液糖锤度、酒精浓度、挥发酸和残糖含量。

1.4.4 正交实验优化酶制剂添加量

在单因素实验基础上对果胶酶、木瓜蛋白酶、溶菌酶做3因素3水平正交实验，如表1所示，以发酵结束发酵成熟醪酒精浓度、挥发酸和残糖为衡量参数，优化复合酶制剂的最佳添加浓度。

表1 糖蜜发酵复合酶正交实验表

1.5 检测方法

1.5.1 糖锤度的测定

糖锤度的测定参考《甘蔗糖蜜酒精生产检验方法》中的糖锤度计法[9]。

1.5.2 酒精度的测定

酒精度的测定采用蒸馏-酒度计法。具体操作步骤为：量筒量取100 mL发酵液，放入蒸馏烧瓶内，用100 mL蒸馏水冲洗量筒，也放入蒸馏烧瓶内，蒸馏并收集馏出液100 mL，用酒度计测定馏出液酒精浓度。

1.5.3 挥发酸的测定

采用碱液滴定法测定发酵蒸馏酒液的挥发酸。具体操作步骤为：取步骤 1.5.2节的酒精馏出液 50 mL，加入 0.1%酚酞指示剂 2～3滴，用 0.1 mol/L NaOH标准溶液滴定至溶液呈微红色在30 s不消失为止，记录消耗NaOH溶液的毫升数。

1.5.4 残还原糖的测定

采用 3,5-二硝基水杨酸比色法(DNS法)测定残还原糖的含量[10]。

1.6 数据处理与分析

每组实验重复 3次，实验结果取平均值，用Excel软件对实验数据进行统计和绘图，SPSS 19.0进行正交实验数据分析。

2 结果与讨论

2.1 不同果胶酶添加量对发酵的影响

高浓度糖蜜中胶体等粘性物质较多，果胶是以半乳糖醛酸为主的复合多糖类物质，高浓发酵时醪液的粘度很大，给酒精的浓醪发酵带来困难。本文分别选择果胶酶不同添加量，以发酵成熟醪锤度、酒精浓度、残糖和挥发酸作为衡量指标，研究果胶酶最适添加量。结果如表2和图2～5所示。

表2 不同果胶酶添加量对发酵的影响

从表2和图2～5可以看出，随着果胶酶添加量的增加，发酵后锤度不断降低，发酵含酒分升高，残糖和挥发酸不断降低。当果胶酶添加量为15 U/g时，发酵效果相对最好，发酵后锤度最低，发酵酒分最高，残糖分最低。这是由于糖蜜中的果胶在果胶酶的作用下，切断果胶分子的α-1,4糖苷键，分解成半乳糖醛酸和还原糖等小分子糖[11]，可显著降低醪液粘度，增加可发酵糖的含量，提高发酵酒精浓度。果胶酶添加量15 U/g为最适添加量。

图2 果胶酶添加量对发酵锤度的影响

图3 果胶酶添加量对发酵酒度的影响

图4 果胶酶添加量对发酵残糖的影响

图5 果胶酶添加量对发酵挥发酸的影响

2.2 不同木瓜蛋白酶添加量对发酵的影响

糖蜜中含有一定量的蛋白质(包括微生物菌体细胞)，蛋白酶可将蛋白质水解为氨基酸，酵母可以利用氨基酸作为氮源合成细胞。分别选择木瓜蛋白酶不同添加量，以发酵成熟醪锤度、酒精浓度、残糖和挥发酸作为测定指标，研究木瓜蛋白酶最适添加量。结果如表3和图6～9所示。

从表3和图6～9可以看出，随着木瓜蛋白酶添加量的增加，发酵后锤度不断降低，发酵含酒分升高，残糖和挥发酸不断降低，当木瓜蛋白酶添加量为16 U/g发酵效果相对最好，发酵后锤度最低，发酵酒分最高，残糖分最低，发酵最彻底。酵母利用蛋白酶分解的氨基酸作为氮源合成细胞，使酵母细胞密度提高，以生长优势抑制杂菌[12]，因此，提高了发酵酒分，降低了细菌代谢产生的挥发酸。木瓜蛋白酶添加量16 U/g为最适添加量。

表3 不同木瓜蛋白酶添加量对发酵的影响

图6 木瓜蛋白酶添加量对发酵锤度的影响

图7 木瓜蛋白酶添加量对发酵酒度的影响

图8 木瓜蛋白酶添加量对发酵残糖的影响

图9 木瓜蛋白酶添加量对发酵挥发酸的影响

2.3 不同溶菌酶添加量对发酵的影响

糖蜜中含有少量的微生物菌体细胞，发酵过程中也可能感染细菌，溶菌酶可将细菌细胞分解，本实验分别选择溶菌酶不同添加量，以发酵成熟醪锤度、酒精浓度、残糖和挥发酸作为测定指标，研究溶菌酶最适添加量。结果如表4和图10～13所示。

从表4和图10～13可以看出来随着溶菌酶添加量的增加，发酵后锤度不断降低，发酵含酒分升高，残糖和挥发酸不断降低，当溶菌酶添加量为20 U/g时发酵后锤度最低，发酵酒分最高，残糖分最低，发酵效果相对最好，发酵最彻底，溶菌酶添加量20 U/g为溶菌酶最适添加量。原因是溶菌酶可将发酵液中细菌细胞分解，直接杀灭杂菌，细菌分解产物氨基酸作为氮源合成酵母细胞，有利于提高酵母细胞密度，进一步抑制杂菌[12]。

表4 不同溶菌酶添加量对发酵的影响

图10 溶菌酶添加量对发酵锤度的影响

图11 溶菌酶添加量对发酵酒度的影响

图12 溶菌酶添加量对残糖分的影响

图13 溶菌酶添加量对挥发酸的影响

2.4 糖蜜发酵酒精复合酶添加量优化正交试验分析

糖蜜发酵酒精优化复合酶添加量3因素3水平正交试验 L9(33)结果见表 5。由实验结果可知，A2B2C3组合的发酵酒度最高为 9.72%。由极差R大小分析，确定各因素对发酵酒度的影响主次顺序为：A＞C＞B，即果胶酶对发酵酒精度的影响最显著，溶菌酶次之，木瓜蛋白酶影响最小；以酒精浓度为主要评价指标各因素最优组合为 A3B2C3。用最优因素组合A3B2C3进行了3次平行验证试验，实验结果如表6所示，发酵酒度的平均值为9.96%，比实验系号5提高了2.45%，因此选择A3B2C3为糖蜜无酸发酵各种酶制剂最佳配比，即果胶酶添加量为20 U/g，木瓜蛋白酶添加量为16 U/g，溶菌酶添加量为24 U/g。

表5 糖蜜发酵酒精优化复合酶添加量正交试验L9(33)

表6 正交实验最优组合验证发酵试验

3 结论与讨论

本研究首先对糖蜜进行无酸澄清处理配制成发酵培养基，然后接种活化的干酵母，分别添加不同浓度的果胶酶、木瓜蛋白酶、溶菌酶进行单因素试验，果胶酶浓度在15 U/g，木瓜蛋白酶浓度在16 U/g，溶菌酶浓度在20 U/g时，发酵效果相对最好，即发酵后锤度最低，酒度最高，残糖和挥发酸也最低。进一步通过 L9(33)正交试验优化复合酶添加量，以发酵酒度作为评价指标，最优组合为 A3B2C3，即果胶酶添加量20 U/g，木瓜蛋白酶添加量为16 U/g，溶菌酶添加量为24 U/g，对应发酵酒度的为9.96%，比添加上述单种酶最高酒度分别提高了 3.75%、11.91%、2.68%。糖蜜发酵酒精中添加果胶酶、木瓜蛋白酶和溶菌酶等复合酶制剂代替硫酸抑制杂菌，能明显提高发酵成熟醪液酒精浓度。随着制糖提糖技术的提高，作为副产物糖蜜中的胶体、灰分和杂菌的含量不断增高[8]，以果胶酶、蛋白酶和溶菌酶等酶制剂代替硫酸对糖蜜进行澄清处理后发酵，将能取得更好的发酵效果，同时能降低酒精添加硫酸对生产设备和环境的危害，有利于糖蜜酒精生产企业减排增效。